雞傳染性支氣管炎病毒HH06株膜蛋白多克隆抗體制備及生物學功能研究

李廣興，杜威威，韓 溪，潘 龍，王 新，白 妍，洪 琴,2，馬 玲，任曉峰，楊貴君

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030；2.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司，上海 200131）

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的急性、高度接觸性呼吸道傳染病，可引起雞呼吸道、輸卵管、腎臟、腸道、肌肉及腺胃等多種組織器官發(fā)生病變[1]。日齡雞均可感染，導(dǎo)致生長遲緩、死亡、增重和飼料報酬降低等[2]。根據(jù)IBV對組織的親嗜性、損害的主要器官、引起主要癥狀不同，將IBV分為呼吸型、腎型和腸型等毒株。

雞傳染性支氣管炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬第Ⅲ抗原群成員，為有感染性線狀單股正鏈RNA病毒，大小約27.6 ku[3]。IBV基因組編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、核衣殼蛋白（N）、膜蛋白（M）和小膜蛋白（E）；其中M蛋白位于病毒外表面，是含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，占病毒總量的40%[4]，與S蛋白共同構(gòu)成病毒外膜，M蛋白由224～225個氨基酸構(gòu)成，橫跨囊膜，大部分在囊膜內(nèi)側(cè)，僅一小端糖基化N端暴露在膜外。據(jù)其糖基化程度的不同分子質(zhì)量為23～34 ku[5]，M蛋白膜外部分親水端含有多個糖基化位點，導(dǎo)致M蛋白多態(tài)現(xiàn)象產(chǎn)生，其對病毒傳染性具有決定性作用[6]。M蛋白與IBV的抗原性及其感染性有關(guān)[7]，抗M蛋白抗體可中和病毒，在補體參與下可殺滅病毒[8-9]。王晶鈺等報道M蛋白的位置可決定IBV的出芽位置，可能與病毒的復(fù)制有關(guān)[10-12]。IBV M基因相對保守，其中M蛋白親水區(qū)比疏水區(qū)易發(fā)生變異，主要是由于基因的替代、插入和刪除而導(dǎo)致變異[13]。在研究IBV保守性和重組情況時發(fā)現(xiàn)，其M蛋白與其他IBV同源率僅有85.8%～88.8%[14]。本研究通過原核表達系統(tǒng)表達IBV HH06株M截短蛋白，將純化后的重組蛋白免疫新西蘭白兔制備其多克隆抗體，對其生物學特性進行鑒定，表明其不僅可用于IBV診斷，也為進一步研究該蛋白在IBV復(fù)制過程中的功能等奠定基礎(chǔ)。因此，研究我國IBV分離株M基因的遺傳變異情況，對掌握IBV在我國發(fā)生發(fā)展情況，篩選有效IBV疫苗株以及開發(fā)具有較強保護性的M基因基因工程疫苗或M蛋白ELISA診斷試劑盒具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和菌株、病毒株、質(zhì)粒

IBV HH06株由東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院獸醫(yī)病理解剖實驗室分離鑒定保存；克隆宿主菌E.coliJM109和表達宿主菌E.coliRosetta（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司；pET-30a（+）原核表達載體質(zhì)粒和PVAX1真核表達載體質(zhì)粒由東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院獸醫(yī)病理解剖實驗室保存；新西蘭雌性白兔購自哈爾濱市某養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑

ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ和XhoⅠ）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和核酸及蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker等均購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒和DNA膠回收試劑盒為北京索萊寶生物工程公司產(chǎn)品；HRP和FITC標記的山羊抗兔IgG均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；OPD鄰苯二胺、四氯萘酚為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank上公布的IBV SC021202株（EU714029.1）核苷酸序列，用Oligo 6.0設(shè)計1對特異性引物（IBV-M-F/R），擴增IBV HH06株M基因，預(yù)期擴增的片段長度約為687 bp。根據(jù)上述引物擴增克隆得到的HH06株M基因序列，采用DNAStar軟件進行預(yù)測分析，選擇表達蛋白抗原性及親水性較好的序列設(shè)計合成2對引物，分別擴增原核（M1Y-F/R）和真核表達蛋白（M1Z-U/L）的目的基因，擴增目的片段預(yù)期大小為384 bp。上述引物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1所示。

表1 擴增M和M1基因的引物序列Table 1 Primers for amplification of M and M1 gene

1.4 M全基因的PCR擴增及蛋白質(zhì)預(yù)測分析

IBV HH06株雞胚尿囊液RNA的提取按TRIzol Reagent說明書進行。以O(shè)ligo dT18為反轉(zhuǎn)錄引物，參照MLV反轉(zhuǎn)錄操作說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。然后以合成的cDNA為模板，以IBV-M-F/R為上下游引物PCR擴增M全基因。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。擴增結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物，用8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確的PCR產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒進行純化回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后進行測序鑒定。利用DNAStar軟件預(yù)測M基因編碼氨基酸的親水性、表面可及性和抗原性指數(shù)。

1.5 M部分基因的擴增及原核重組質(zhì)粒pET30a-M1和真核重組質(zhì)粒PVAX-M1的構(gòu)建

以M全基因為模板，分別以M1AF/M1AR和M1AU/M1AL為引物PCR擴增截短的M1基因，反應(yīng)條件同上。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定正確后用DNA膠回收試劑盒回收、純化目的基因。

PCR回收產(chǎn)物和pET-30a（+）質(zhì)粒、PVAX1質(zhì)粒分別用EcoR I和XhoI雙酶切，膠回收后用T4DNA連接酶進行連接。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)后挑取單菌落置于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12～15 h，提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進行測序，并將重組質(zhì)粒命名為pET30a-M1或PVAX-M1。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定

將重組質(zhì)粒pET30a-M1和空載體pET-30a（+）分別轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta（DE3）感受態(tài)中，涂布于含卡那抗性的LB平板上挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。將PCR鑒定正確的重組菌液進行活化，37℃培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達。期間每隔1 h取1 mL菌液作為小時樣品（0～5 h），6 h后收集菌體，離心后PBS懸起超聲波破碎，再離心后分別收集沉淀和上清進行SDS-PAGE分析重組蛋白。鑒定正確的表達產(chǎn)物采用切膠純化方法回收重組蛋白，獲得的產(chǎn)物命名為重組M1蛋白，并進行SDS-PAGE分析鑒定。重組M1蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以IBV全病毒多可隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG抗體為二抗，四氯萘酚顯色進行檢測。

1.7 多克隆抗體的制備

選取健康的新西蘭雌性白兔，將純化后的重組M1蛋白（濃度為1800 μg· mL-1）與弗氏完全佐劑等比例混合充分乳化，于背部皮下多點注射，2 mg·只-1。兩周后每隔一周以弗式不完全佐劑與重組M1蛋白等比例混合充分乳化進行免疫，1 mg·只-1。四免后將純化蛋白與無菌PBS的混合溶液經(jīng)耳緣靜脈注射加強免疫，500 μg·只-1。7 d后心臟采血，4℃3000 r·min-1離心20 min收集多抗血清，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 多克隆抗體的鑒定

1.8.1 間接ELISA檢測抗體效價

純化的重組蛋白用包被液稀釋至10 μg·mL-1，每孔100 μL，包被酶標板，同時設(shè)置陰性對照和空白對照。以不同稀釋度的多抗血清為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗，鄰苯二胺（OPD）為底物避光顯色，酶標儀檢測各孔OD490nm值。

1.8.2 Western blot檢測抗體特異性

經(jīng)上樣緩沖液處理后的HH06純化病毒和重組M1蛋白分別進行SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用50 g·L-1脫脂乳4℃封閉過夜后，將膜置于1∶500稀釋的M1多抗血清中37℃溫育1 h，再與1∶1000稀釋的HRP標記山羊抗兔IgG反應(yīng)1 h，四氯萘酚顯色。

1.8.3 間接免疫熒光檢測

待BHK-21細胞長至70%左右，將重組真核質(zhì)粒PVAX-M1和PVAX1空載體分別轉(zhuǎn)染BHK-21細胞。Vero細胞長滿單層后接種B株IBV，同時設(shè)未接毒細胞對照，轉(zhuǎn)染后24 h（接毒后30 h）多聚甲醛室溫固定30 min，以1∶100倍稀釋的M1多抗血清為一抗，1∶1000倍稀釋的FITC標記山羊抗兔IgG為二抗，進行間接免疫熒光試驗。

1.8.4 多抗血清的病毒抑制試驗

M1多抗血清56℃滅活后，按1∶4～1∶64進行倍比稀釋，然后與等體積100TCID50的IBV混合，37℃作用1 h后，加入96孔板培養(yǎng)的單層Vero細胞孔內(nèi)，各稀釋度接種3孔。同時設(shè)病毒、無關(guān)血清及細胞空白對照。接毒后72 h使用MTT法判定多克隆抗血清對病毒感染細胞的抑制率，根據(jù)抑制率公式進行計算：病毒抑制率（%）=（細胞對照OD490-血清OD490）/（細胞對照OD490-病毒OD490）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBV HH06株M基因的擴增及蛋白質(zhì)分析

提取IBV HH06株總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)特異性引物RT-PCR擴增出M基因，目的基因大小為678 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期大小一致（見圖1）。

圖1 PCR擴增M基因Fig.1 PCR product of M gene

利用DNAStar軟件對M基因編碼氨基酸的親水性、表面可及性和抗原性指數(shù)進行分析，發(fā)現(xiàn)M蛋白含有親水區(qū)和三個跨膜疏水區(qū)。N端前20個氨基酸為親水區(qū)與第一個跨膜疏水區(qū)構(gòu)成M蛋白的膜外區(qū)。緊鄰的約80個氨基酸殘基構(gòu)成三個α-螺旋疏水區(qū)，至少跨膜三次。其余的C端區(qū)氨基酸（約占M蛋白的一半）幾乎都位于脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)部，分析顯示其抗原的親水性較強，潛在的抗原決定簇比較集中且較多，說明該部分蛋白的抗原指數(shù)較高，抗原表位較多，去除N端的三個跨膜疏水區(qū)更利于蛋白質(zhì)表達，同時對蛋白質(zhì)抗原性指數(shù)和活性的改變較小。

2.2 重組表達質(zhì)粒pET30a-M1和PVAX-M1的構(gòu)建

將亞克隆的M1基因插入pET-30a（+）原核表達載體和PVAX1真核表達載體，經(jīng)PCR和酶切鑒定結(jié)果表明重組表達質(zhì)粒pET30a-M1和PVAX-M1均構(gòu)建成功（見圖2），測序結(jié)果顯示克隆序列正確。

圖2 重組質(zhì)粒PCR及酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid

2.3 PET-M1蛋白的表達及Western blot分析

SDS-PAGE顯示，重組菌液經(jīng)誘導(dǎo)后在20 ku處出現(xiàn)特異性蛋白條帶，并且主要以包涵體形式表達，切膠純化效果良好，重組蛋白的分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致（見圖3）。

圖3 表達產(chǎn)物（A）和純化蛋白（B）的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed M1 recombinant protein（A）and purified protein(B)in E.coli

以IBV全病毒多克隆抗體為一抗，HPR標記的羊抗兔IgG為二抗進行Western blot，在20 ku處可見特異性條帶（見圖4）。

圖4 Western blot檢測M1重組蛋白Fig.4 Detection of the recombinant M1 protein in E.coli by western blot

2.4 多克隆抗體制備及其鑒定

2.4.1 多克隆抗體效價檢測和Western blot分析

將純化后的重組M1蛋白免疫新西蘭雌性白兔，制備M1多克隆抗體。采用間接ELISA方法檢測該多抗血清的抗體效價可達1∶218，同時與IBV HH06株反應(yīng)效價可達1∶214。Western blot結(jié)果表明，該多克隆抗體與未純化的重組M1蛋白和IBV HH06株在20 ku處均出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，表明制備的抗體具有良好的特異性及反應(yīng)性（見圖5）。

圖5 多克隆抗體Western blot鑒定Fig.5 Identification of polyclonal antibody with Western blot

2.4.2 多克隆抗體IFA檢測

間接免疫熒光試驗結(jié)果顯示，經(jīng)IBV Beaudette感染的Vero細胞以及轉(zhuǎn)染真核質(zhì)粒PVAX-M1的BHK-21細胞可以檢測到較強的特異性熒光信號，而非感染細胞、轉(zhuǎn)染PVAX1空載體細胞對照孔未能檢測到綠色熒光（見圖6）。

圖6 多克隆抗體IFA檢測Fig.6 Assay of the polyclonal antiserum with indirect fluorescence antibody

2.4.3 病毒感染抑制試驗

用DMEM倍比稀釋最大無毒濃度的多抗血清和對照血清（2-2～2-6），檢測不同稀釋度血清對Beaudette株IBV感染Vero細胞的抑制效果。結(jié)果顯示，多抗血清的抑制率隨血清稀釋度增加而減弱，當多抗血清稀釋度為2-2時，其對病毒的抑制率最大，達25.9%；而對照血清對IBV感染Vero細胞幾乎無抑制作用（見圖7）。并且細胞對照孔的細胞生長良好，病毒感染孔的細胞出現(xiàn)明顯病變。這表明，該多抗血清雖然對IBV感染細胞的抑制率較低但仍具有抗病毒感染活性。

圖7 多抗血清抗病毒感染作用Fig.7 Inhibition rate of anti-IBV infection by polyclonal antiserum

3 討論與結(jié)論

M蛋白由mRNA4編碼，大部分位于囊膜內(nèi)側(cè)，約10%N端暴露于囊膜外并被糖基化，形成N-連接的寡聚糖，形成抗原決定簇。M蛋白約占病毒蛋白總量40%，由224～225個氨基酸組成，分子質(zhì)量為23 ku，因其糖基化程度不同分子質(zhì)量為23～35 ku。

M蛋白是傳染性支氣管炎病毒中次重要糖蛋白，因未知因素，冠狀病毒M蛋白體外表達困難。分析原因可能與M蛋白在細胞中表達并積累到一定量時破壞細胞壁有關(guān)，因此會出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象。M蛋白的N端前20個氨基酸具有親水性特征，緊鄰的約80個氨基酸殘基構(gòu)成3個α螺旋疏水區(qū)，至少跨膜3次，這種跨膜結(jié)構(gòu)是影響表達的原因。M基因存在大量大腸桿菌稀有密碼子（約占12.1%），部分以串聯(lián)形式存在，影響M蛋白原核表達。因此，本研究之初對全基因進行誘導(dǎo)表達，更換幾種表達載體和誘導(dǎo)條件均未獲得成功，一直不能對其進行全長表達。用DNAStar軟件分析，M蛋白的跨膜區(qū)位于N端，其抗原表位主要集中在C端，經(jīng)分析去除三個跨膜疏水區(qū)，選擇抗原表位集中的C端378 bp（126個AA）M基因進行表達，最終用pET-30a表達載體經(jīng)誘導(dǎo)后成功表達。這可能是由于截短的M1基因不含其疏水區(qū)且稀有密碼子減少，使外源基因獲得高效的表達。同時，對重組蛋白進行Western Blot檢測表明，該蛋白具有良好免疫原性，可反映天然蛋白生物學活性。

制備高效價抗體是示蹤基因表達和研究基因功能前提。本研究將純化的IBV重組M1蛋白與佐劑乳化后免疫新西蘭白兔，獲得重組M1蛋白多克隆抗體。間接ELISA檢測抗體效價可達1∶218，與IBV HH06株反應(yīng)效價達1∶214，Western Blot試驗表明，制備多抗與重組M1蛋白和IBV HH06株均具有良好的反應(yīng)性和特異性。間接免疫熒光結(jié)果表明，本研究獲得的多克隆抗體可以檢測到真核表達的M1蛋白，同時，本試驗還構(gòu)建表達M蛋白的真核重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后也可被檢測到，表明表達截短的膜外區(qū)M1蛋白多克隆抗體可作為一種特異性抗體檢測M蛋白，同時該抗體還與IBV B株發(fā)生特異性反應(yīng)。以上結(jié)果表明，本研究制備的多克隆抗體具有良好的生物學活性，可為后續(xù)IBV研究奠定基礎(chǔ)。

IBV在細胞內(nèi)復(fù)制時，M蛋白C末端在病毒出芽時與核衣殼蛋白相互作用，M蛋白在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中聚集，形成病毒出芽位點，說明M蛋白可能與病毒的復(fù)制有關(guān)[15]。McBride等報道M蛋白膜外區(qū)部分可與S蛋白協(xié)同在病毒吸附細胞過程中發(fā)揮重要作用[16]。本試驗發(fā)現(xiàn)將IBV M1蛋白多克隆抗體與IBV病毒粒子作用后，其抑制病毒感染效果較病毒感染對照處理只達到25.9%，抑制效率較低?？赡苡捎诮囟痰腗1蛋白缺失膜外區(qū)和跨膜區(qū)存在的關(guān)鍵性表位，與病毒的吸附和復(fù)制過程有關(guān)，導(dǎo)致多抗血清對病毒抑制率較低。包含膜外區(qū)的M完整蛋白不易表達[17]，與本試驗結(jié)果相似，相應(yīng)抗體制備在國內(nèi)未見報道，M蛋白表達及其優(yōu)化有待于進一步研究。制備M蛋白抗體，可為進一步研究該蛋白在IBV復(fù)制過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

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