GDNF 及dbcAMP 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元作用的實(shí)驗(yàn)研究

陳 立，杜 娟，陳 麗，呂曉紅

帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理變化是路易小體形成和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失，目前的治療只能通過多巴胺替代療法改善其癥狀，并不能阻止病情的進(jìn)展。神經(jīng)干細(xì)胞的全能性和成體干細(xì)胞橫向分化的多潛能性為帕金森的治療提供了新的思路和方法。本實(shí)驗(yàn)利用神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF 及dbcAMP 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)及聯(lián)合誘導(dǎo)，希望能獲得足夠數(shù)量的多巴胺能神經(jīng)元，為定向誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元進(jìn)一步應(yīng)用于臨床打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)孕14～16 d Wistar 大鼠由吉林大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑 培養(yǎng)基DMEM/F12、B27(Gibco)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)(Peprotech)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司)，二丁酰環(huán)磷腺苷酸(dibutyryl adenosine 3’，5’cyclic monophosphate，dbcAMP)(Santa)，兔抗鼠神經(jīng)元特異性中間絲(Neuron-specific intermediate filament，Nestin)、兔抗鼠5-溴脫氧尿苷(5-Bromodeoxyuridine，Brdu)、兔抗鼠絡(luò)氨酸羥化酶(TH)多克隆抗體、山羊抗兔免疫組化試劑盒、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗兔IgG(武漢博士德公司)。

1.3 神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離及原代培養(yǎng) 神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng) 取妊娠14～16 d 的Wistar 大鼠，給予乙醚吸入麻醉，無菌操作取出胚胎，置于冰浴的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi)，分離胚胎中的腦組織，小心剝離腦膜及血管，將取出的腦組織剪成小組織塊，加入0.125% 胰蛋白酶消化30 min 左右，用含10% 胎牛血清終止消化，0.01%DNaseI 繼續(xù)對(duì)腦組織消化30 min 左右，離心，將離心后的細(xì)胞懸浮于干細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基包含bFGF 20 ng/ml 和EGF 20 ng/ml 及DMEM/F12 培養(yǎng)基(另含2% B27，HEPES 10 mmol/L，谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100 U/ml)，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml，接種至25 ml 培養(yǎng)瓶。在37℃飽和濕度、5% CO2/95%空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d 半量換液1 次，7 d 傳代1 次。

1.4 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定 待培養(yǎng)至1 w 左右時(shí)取細(xì)胞懸液1 瓶，細(xì)胞離心(1000 r/min，5 min)后棄上清，重懸，吸管吹打分離細(xì)胞克隆，注意力度要適當(dāng)均勻，重新細(xì)胞計(jì)數(shù)后以5×104/ml 接種于裝有細(xì)胞爬片的24 孔板內(nèi)，進(jìn)行Nestin 及Brdu 鑒定。

1.5 NSC 的誘導(dǎo)分化 取第2 代的NSC 以1×105/ml 的密度接種于置有預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸包被蓋玻片的24 孔培養(yǎng)板。分別加入以下培養(yǎng)液:A組(對(duì)照組)DMEM/F12+10% FBS+2% B27，B組加入20 ng/ml GDNF，C 組加入200 μmol/L dbcAMP，D 組加入200 μmol/L dbcAMP+20 ng/ml GDNF。每組3 孔，以后每3 d 半量換液1 次，分化7 d 后終止誘導(dǎo)。

1.6 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 取出終止誘導(dǎo)的細(xì)胞爬片，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min，0.3% TritonX-100 中室溫下孵育標(biāo)本15 min，3% H2O2(0.01 mol/L PBS 配制)處理標(biāo)本10 min，一抗分別為小鼠抗人Nestin 單克隆抗體，兔抗Brdu(1∶100)，兔抗TH 多克隆抗體，4 ℃濕盒過夜(一抗用PBS 稀釋)，滴加二抗37 ℃孵育標(biāo)本30 min，滴加試劑SABC，20～37 ℃條件下20 min，DAB 避光顯色5～10 min，蘇木素復(fù)染，自來水返藍(lán)，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 免疫細(xì)胞化學(xué)染色TH 陽性的細(xì)胞代表多巴胺(Dopamine，DA)能神經(jīng)元。TH 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%即為所得TH 陽性細(xì)胞率。所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±s 表示，TH 細(xì)胞陽性率的多組樣本均數(shù)的比較用單因素方差分析。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕14～16 d Wistar 大鼠無血清培養(yǎng)

在無血清，神經(jīng)營養(yǎng)因子培養(yǎng)條件下，24 h 可見少量細(xì)胞貼壁(見圖1)，大部分細(xì)胞懸浮生長，部分細(xì)胞分裂成3～4 個(gè)細(xì)胞團(tuán)，隨著時(shí)間推移，細(xì)胞團(tuán)數(shù)量逐漸增多，體積增大，大部分懸浮生長，成球形，折光性較好，無細(xì)胞突起(見圖2)，培養(yǎng)至1 w倒置顯微鏡觀察可見大量懸浮生長的神經(jīng)球，少量神經(jīng)球貼壁并有突起。

2.2 Nestin 鑒定

收集培養(yǎng)1 w 的神經(jīng)干細(xì)胞球制作細(xì)胞爬片，行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，結(jié)果顯示神經(jīng)球呈現(xiàn)棕黃色，表明其具備干細(xì)胞特性(見圖3、圖4)。

2.3 Brdu 鑒定

收集細(xì)胞前24 h 給予Brdu，后制作細(xì)胞爬片，行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示大部分神經(jīng)球呈現(xiàn)棕黃色，與對(duì)照組相比具有明顯差異，表明其具備干細(xì)胞增殖分化的能力(見圖5、圖6)。

2.4 神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的鑒定

2.4.1 血清分化組 通過免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，TH 陽性細(xì)胞數(shù)目很少，平均陽性率0.67%(見圖7)。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)組A(不同劑量組GDNF 誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化)加入GDNF10 μg/L，20 μg/L 及40 μg/L 分化1W 平均陽性率為7.1%，10.2%，10.0%。GDNF 組與血清對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，GDNF 在20 μg/L 濃度誘導(dǎo)下分化效率最高(見圖8、圖9)，GDNF 在40 μg/L 時(shí)分化率沒有明顯提高。

2.4.3 實(shí)驗(yàn)組B(不同劑量組dbcAMP 誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化)加入dbcAMP100 μmol/L，200 μmol/L 及400 μmol/L 分化1W 平均陽性率為4.56%，7.99%，7.25%。dbcAMP 組與血清對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，dbcAMP 在200 μmol/L 濃度誘導(dǎo)下分化效率最高(見圖10、圖11)，dbcAMP 在200 μmol/L 及400 μmol/L 濃度設(shè)置下TH 細(xì)胞陽性率差別不大。

2.4.4 實(shí)驗(yàn) 組C(GDNF20 μg/L 聯(lián)合dbcAMP200 μmol/L 誘導(dǎo)分化)選取GDNF 及dbcAMP 單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)TH 細(xì)胞陽性率最高時(shí)的濃度進(jìn)行組合，分別加入GDNF20 μg/L，dbcAMP200 μmol/L，分化1W 后TH 細(xì)胞平均陽性率為13.36%，與單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)分化率相比可進(jìn)一步提高(見圖12)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 GDNF 及dbcAMP 聯(lián)合誘導(dǎo)分化后TH 陽性細(xì)胞表達(dá)率(%，±s)

表1 GDNF 及dbcAMP 聯(lián)合誘導(dǎo)分化后TH 陽性細(xì)胞表達(dá)率(%，±s)

各實(shí)驗(yàn)組分別與A 組比較△P＜0.05;B 組、C 組分別與D 組比較* P＜0.05

3 討論

1992 年Reynolds 和Richards 最先從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出能夠進(jìn)行自我更新的多潛能細(xì)胞群落，由此提出了神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的概念。2000 年Gage［1］將神經(jīng)干細(xì)胞概括為可生成神經(jīng)組織或者來源于神經(jīng)系統(tǒng)的具有自我更新能力并且能夠通過不對(duì)稱細(xì)胞分裂產(chǎn)生新細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞具有多向分化及自我更新的能力，其主要生物學(xué)屬性包括:(1)自我更新能力;(2)多向分化能力;(3)良好的細(xì)胞整合能力;(4)低免疫原性。

神經(jīng)干細(xì)胞存在于哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的多個(gè)部位，目前已從胚胎期哺乳動(dòng)物的皮質(zhì)區(qū)、海馬、紋狀體、嗅球、側(cè)腦室、間腦、中腦、小腦、脊髓和視網(wǎng)膜中分離得到了干細(xì)胞［2，3］，成年期的哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞主要存在于側(cè)腦室腦室下區(qū)及海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)［4］。

3.1 NSCs 定向分化中多巴胺能相關(guān)誘導(dǎo)劑應(yīng)用機(jī)制的探討

目前神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)中涉及到多種誘導(dǎo)機(jī)制。張文治［5］對(duì)人胚大腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的實(shí)驗(yàn)研究表明，EGF 和bFGF 協(xié)同作用效果明顯優(yōu)于單用，另外Svendsen［6］利用EGF 和FGF-2 體外誘導(dǎo)出能夠長期生存的人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)前體細(xì)胞，并成功移植入帕金森病大鼠模型。本實(shí)驗(yàn)從孕15 d 胎鼠腦組織中提取干細(xì)胞并進(jìn)行無血清培養(yǎng)及傳代，對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定主要采用應(yīng)用比較廣泛的Nestin 蛋白及Brdu 蛋白進(jìn)行標(biāo)記。并采用EGF 和bFGF 聯(lián)合培養(yǎng)，濃度均為20 μg/L，培養(yǎng)結(jié)果顯示二者聯(lián)合應(yīng)用可極大的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。

B27 是一種神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑，由于含有抗氧化劑等成分，能夠減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷，被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)。因此本實(shí)驗(yàn)中也加入了神經(jīng)細(xì)胞添加因子以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。GDNF 是1993 年Lin 等發(fā)現(xiàn)并克隆出來的，它是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，是轉(zhuǎn)化生長因子家族中的一員。

GDNF 廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的的多巴胺區(qū)域，在腹側(cè)蒼白球、嗅結(jié)節(jié)、梨狀區(qū)等也有表達(dá)［7］。近年來，隨著神經(jīng)干細(xì)胞的大量深入研究，GDNF 在其中的作用越來越重要，GDNF 不僅對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有營養(yǎng)、支持、保護(hù)和修復(fù)作用，而且在神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元中也起著重要作用。研究表明，GDNF 主要是通過其受體發(fā)揮作用的［8］。因此本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加GDNF 促進(jìn)干細(xì)胞的分化及維持多巴胺神經(jīng)元的健康生長。

dbcAMP 是一種重要的細(xì)胞內(nèi)分子，它作為第二信使，是細(xì)胞內(nèi)媒介物，在細(xì)胞內(nèi)它可在腺苷酸環(huán)化酶的作用下促使cAMP 合成，其誘導(dǎo)分化作用與其升高細(xì)胞內(nèi)cAMP 程度有關(guān)。Tio 等［9］利用dbcAPM及IBMX 對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)分化的細(xì)胞表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元早期蛋白Nurr1 及TH 蛋白;Roger 等［10］利用dbcAPM 對(duì)小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞(Neuro-2a，N2a)進(jìn)行誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)dbcAPM 能極大的提高TH 細(xì)胞的陽性表達(dá)率，在dbcAMP 的作用下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)及N2a 細(xì)胞均可表達(dá)DA 能神經(jīng)元標(biāo)記蛋白，因此本實(shí)驗(yàn)利用dbcAMP 對(duì)NSCs 進(jìn)行誘導(dǎo)分化，雖然分化比例較低，但仍有TH 陽性細(xì)胞表達(dá)，且與GDNF 聯(lián)合誘導(dǎo)有較高的TH 細(xì)胞表達(dá)率，目前關(guān)于dbcAMP 在NSCs 分化中的作用機(jī)制仍不十分明確。

3.2 GDNF 和dbcAMP 在NSCs 向多巴胺能神經(jīng)元定向分化中的誘導(dǎo)效應(yīng)及有效劑量的探討

Majd 等［11］研究表明在FGF2、BDNF 和GDNF 存在的培養(yǎng)環(huán)境下，使DA 能神經(jīng)元的存活率增強(qiáng)了15 倍，并且促進(jìn)了神經(jīng)突觸的生長。而dbcAMP 促進(jìn)所有神經(jīng)元神經(jīng)突觸的生長，但是不能增加DA能神經(jīng)元的存活。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間逐漸延長，TH 細(xì)胞陽性率逐漸降低，因此本實(shí)驗(yàn)確定誘導(dǎo)分化的時(shí)間為1 w。具體如下:在實(shí)驗(yàn)組A(GDNF組)中，我們?cè)O(shè)置了3 個(gè)不同劑量組:10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L，其中濃度為10 μg/L 時(shí)與血清誘導(dǎo)組相比TH 細(xì)胞陽性率顯著升高，當(dāng)劑量增加到20 μg/L 時(shí)，TH 細(xì)胞陽性率較10 μg/L 時(shí)升高，二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而隨著劑量繼續(xù)增加至40 μg/L時(shí)，TH 細(xì)胞陽性率未再繼續(xù)升高。說明GDNF 在10 μg/L～20 μg/L 范圍內(nèi)存在劑量依賴性。在實(shí)驗(yàn)組B(dbcAMP)中，我們同樣設(shè)置了3 個(gè)不同劑量組:100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L，其中濃度為100 μmol/L 時(shí)與血清誘導(dǎo)組相比TH 細(xì)胞陽性率升高，當(dāng)劑量增加到200 μmol/L 時(shí)，TH 細(xì)胞陽性率較100 μmol/L 時(shí)升高，二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而隨著劑量繼續(xù)增加至400 μmol/L 時(shí)，TH 細(xì)胞陽性率未再繼續(xù)升高。同樣，dbcAMP 在100 μmol/L～200 μmol/L 范圍內(nèi)也存在劑量依賴性。綜合實(shí)驗(yàn)組A及實(shí)驗(yàn)組B 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)組C 中利用二者的最佳濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果顯示二者聯(lián)合誘導(dǎo)較單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)更能促進(jìn)NSCs 向多巴胺能神經(jīng)元分化，二者聯(lián)合具有協(xié)同作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用下，分離的神經(jīng)干細(xì)胞能夠快速增殖并形成神經(jīng)球，GDNF 及dbcAMP 均有誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的作用，其中GDNF 在20 μg/L 時(shí)誘導(dǎo)效能最高，dbcAMP 在200 μmol/L 時(shí)誘導(dǎo)效能最高。二者聯(lián)合誘導(dǎo)作用更佳。

本實(shí)驗(yàn)雖然獲得了預(yù)期結(jié)果，但仍有一些問題有待進(jìn)一步研究，比如，如何獲得用于移植的高純度NSCs;GDNF 及dbcAMP 二者誘導(dǎo)NSCs 分化為多巴胺神經(jīng)元的比例還不是很高;如何誘導(dǎo)出統(tǒng)一的異質(zhì)性較低的不同分化階段的有功能的多巴胺神經(jīng)元尚需進(jìn)一步的努力;誘導(dǎo)分化機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明等。

3.3 NSCs 向多巴胺能定向分化研究應(yīng)用于臨床存在的問題

目前的相關(guān)研究中，重點(diǎn)關(guān)注原生的或者轉(zhuǎn)基因的干/前體細(xì)胞在功能障礙的紋狀體中是否能夠存活、分化及功能融合等問題，包括從培養(yǎng)到移植后功能鑒定的各個(gè)環(huán)節(jié)都需要優(yōu)化。迫切需要優(yōu)化的問題可能有以下幾個(gè)方面:首先，多巴胺神經(jīng)元異質(zhì)性問題。在相關(guān)的人胚胎干細(xì)胞分化為多巴胺神經(jīng)元的報(bào)道中，顯示同為TH 陽性的細(xì)胞中卻存在著明顯的異質(zhì)性，而定向分化的多巴胺細(xì)胞的同質(zhì)性是細(xì)胞移植治療的必要條件。雖然人們已經(jīng)從生物化學(xué)、遺傳學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和電理生理學(xué)特性方面證明:來源于人胚胎干細(xì)胞中腦腹側(cè)的永生的多克隆神經(jīng)干細(xì)胞系可以作為產(chǎn)生A9 多巴胺神經(jīng)元的有效模式系;但是在帕金森大鼠長期體內(nèi)移植的研究表明，該移植物尚不能均勻的成熟［12］。Datta I 等［13］用嚴(yán)格的無血清營養(yǎng)添加合適的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)使人胚胎干細(xì)胞系9(human embryonic stem cell-line，HUES9)相對(duì)比較均一的向多巴胺能神經(jīng)元定向分化，但其移植后細(xì)胞的存活率及功能有待測(cè)定。因此，如何篩選出以同質(zhì)性和克隆性為特點(diǎn)的NSCs，允許具有可控性能的細(xì)胞進(jìn)行移植，是目前學(xué)者對(duì)移植細(xì)胞長期體內(nèi)存活的進(jìn)一步嘗試。

其次，移植前多巴胺細(xì)胞的分化程度問題。Moon［14］應(yīng)用一種PD 基因模型-無晶狀體小鼠，分別在擬胚體(Embryoid Body，EB)、神經(jīng)前體細(xì)胞(Neural Precursor Cells，NP)和已分化的神經(jīng)元(Differented neurons ND)階段對(duì)該模型進(jìn)行細(xì)胞移植治療，結(jié)果表明NP 階段代表移植的最佳階段。

再次，移植后細(xì)胞的存活時(shí)間和功能問題。Ziavra［15］將6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)立體定位注射于小鼠右側(cè)上行黑質(zhì)紋狀體多巴胺通路中并隨后執(zhí)行NPC 移植，接著進(jìn)行脫水嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)和雙向免疫激光共聚焦掃描實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，移植細(xì)胞至少存活3W，移植的神經(jīng)前體細(xì)胞占宿主紋狀體區(qū)域的總體細(xì)胞數(shù)的百分比從0.2%(移植0W)上升到0.6%(移植3W);移植細(xì)胞功能整合在紋狀體中，明顯的減少了脫水嗎啡處理后產(chǎn)生的對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)動(dòng)作。同時(shí)，在紋狀體環(huán)境中GFP 陽性細(xì)胞分化成β-III 微管表達(dá)的神經(jīng)元，而不是膠質(zhì)細(xì)胞。最重要的是，GFP-陽性的細(xì)胞進(jìn)一步分化為多巴胺能(TH-陽性)和中型多棘神經(jīng)元(dopamine and adenosine 3’5’-monophosphate-regulated phosphoprotein，Mr 32 kD，DARPP-32-陽性)表型。

另外，用于臨床試驗(yàn)中的干細(xì)胞來源問題。目前研究發(fā)現(xiàn)以體外產(chǎn)生的早期妊娠骨髓間充質(zhì)為來源的神經(jīng)前體細(xì)胞在體內(nèi)能夠最終分化，并且能夠改善與帕金森相關(guān)的運(yùn)動(dòng)功能。因此胎盤可能是治療神經(jīng)疾病的干細(xì)胞良好來源［16］，或者說胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)是帕金森疾病替代治療(中腦多巴胺神經(jīng)元)的一個(gè)有前景的資源［17］。但是，ESC 的移植模式伴隨著介入不適應(yīng)和致瘤細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。來自于轉(zhuǎn)基因系的經(jīng)流式細(xì)胞儀純化的細(xì)胞移植表明:中期和晚期的細(xì)胞移植物幾乎全部是唯一的DA 神經(jīng)元。中期神經(jīng)元細(xì)胞移植表現(xiàn)出DA 神經(jīng)元存活量最大并在帕金森小鼠模型中誘導(dǎo)出強(qiáng)大的運(yùn)動(dòng)缺陷的恢復(fù)。因此，胚胎干細(xì)胞中期分化的神經(jīng)元最適合進(jìn)行DA 神經(jīng)元移植。

3.4 神經(jīng)干細(xì)胞移植治療PD 的展望

PD 是中老年人常見神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理改變是路易小體形成和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失，由于其病因及發(fā)病機(jī)制尚未徹底明了，雖然通過多巴胺替代療法可以改善癥狀，但并不能阻止病情進(jìn)展，而且藥物替代治療不可避免的副作用也限制其臨床長期應(yīng)用。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為帕金森病的治療提供了新的思路和方法。通過移植多巴胺能神經(jīng)元替代已經(jīng)變性的神經(jīng)元，恢復(fù)黑質(zhì)紋狀體多巴胺系統(tǒng)的完整性并改善其功能，神經(jīng)干細(xì)胞治療可能是帕金森病眾多治療方案中一項(xiàng)非常有前途的治療措施。目前已有很多關(guān)于應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞治療PD 的基礎(chǔ)及臨床實(shí)驗(yàn)研究。Mimura 等［18］證實(shí)腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元移植可以使帕金森動(dòng)物模型的行為學(xué)得到改善。2005 年Takagi 等［19］在猴的胚胎干細(xì)胞中加入FGF20 進(jìn)行誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)出大量多巴胺能神經(jīng)元，后移植到經(jīng)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-phenyl-1，2，3，6-tetrahydro pyridine，MPTP)處理的帕金森模型猴，移植后性能鑒定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)存活的移植細(xì)胞能夠行使多巴胺神經(jīng)元的功能，并顯著改善帕金森病模型猴的行為學(xué)癥狀。由于MPTP 誘導(dǎo)產(chǎn)生的帕金森病模型非常接近人類帕金森病，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于細(xì)胞移植應(yīng)用于臨床具有極高的預(yù)測(cè)性［20］。Levesque 從神經(jīng)外科手術(shù)中獲得了皮質(zhì)及皮質(zhì)下腦組織，并從中成功分離出大量神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)數(shù)月，經(jīng)誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)出大量多巴胺能神經(jīng)元及γ-氨基丁酸能神經(jīng)元后，研究人員將其移植到帕金森病患者的大腦紋狀體內(nèi)，應(yīng)用帕金森病統(tǒng)一評(píng)分量表進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示:術(shù)前服用抗帕金森藥物的患者癥狀改善達(dá)81%;移植術(shù)后2 y 該批患者癥狀改善達(dá)83%，術(shù)后5 y 評(píng)分回歸基線。該實(shí)驗(yàn)表明移植的神經(jīng)元能長時(shí)間的改善帕金森病患者的癥狀，同時(shí)也證明神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森病的前景非常誘人［21］。因此，獲得足夠數(shù)量的多巴胺能神經(jīng)元是細(xì)胞移植的基礎(chǔ)，而且移植源能夠改善帕金森模型鼠的行為學(xué)癥狀，說明細(xì)胞移植治療在理論上是可行的。任何可以顯著提高神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法或方式都是值得嘗試的;在不違背倫理學(xué)的基礎(chǔ)上，更多的從來源、定向分化到移植到功能改善的各個(gè)環(huán)節(jié)的優(yōu)化都是值得探索的。

圖1 原代培養(yǎng)24 h 細(xì)胞克隆(×200)

圖2 原代培養(yǎng)3 d 細(xì)胞克隆(×200)

圖3 未加一抗細(xì)胞陰性對(duì)照(DAB，×200)

圖4 特異性標(biāo)記物Nestin 表達(dá)(DAB，×200)

圖5 未加一抗細(xì)胞陰性對(duì)照(DAB，×400)

圖6 細(xì)胞中Brdu 表達(dá)(DAB，×400)

圖7 TH 細(xì)胞在分化中的陰性表達(dá)(DAB，×400)

圖8 GDNF 10 μg/L 誘導(dǎo)7d TH細(xì)胞表達(dá)(FITC，×400)

圖9 GDNF 20 μg/L 誘導(dǎo)7dTH 細(xì)胞表達(dá)(FITC，×400)

圖10 dbcAMP 100 μmol/L 誘導(dǎo)7d TH 細(xì)胞表達(dá)(DAB，×400)

圖11 dbcAMP 200 μmol/L 誘導(dǎo)7d TH 細(xì)胞表達(dá)(DAB，×400)

圖12 GDNF 20 μg/L 聯(lián)合dbcAMP 200 μmol/L 誘導(dǎo)7d TH 細(xì)胞表達(dá)(DAB，×400)

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