黃桿菌肝素酶Ⅱ重組菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及高密度發(fā)酵

周斌，程詠梅，鄧超，劉衛(wèi)超，陳潮梁，陳敬華，許正宏

1江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122

2江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122

肝素酶是指一類作用于肝素或者硫酸乙酰肝素的多糖裂解酶。目前從肝素黃桿菌中提取的肝素酶主要為肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種[1]。其中肝素酶Ⅱ有較寬的底物選擇性，可以特異性切割肝素、硫酸乙酰肝素類分子內(nèi)的連接鍵，主要應(yīng)用于闡明肝素的結(jié)構(gòu)[2]、研究抗凝血機(jī)制[3]、制備抗腫瘤藥物[4]及低分子量肝素[5]等。傳統(tǒng)生產(chǎn)肝素酶的方法是肝素黃桿菌發(fā)酵法。Galliher等[6]采用合成培養(yǎng)基代替天然培養(yǎng)基，以肝素作誘導(dǎo)劑，將肝素酶總酶活提高了4倍。此后他們研究了不同碳氮源、誘導(dǎo)劑對(duì)酶活的影響，并采用流加補(bǔ)料方式發(fā)酵，將總酶活提高近60倍[7]，此方法得到的肝素酶為肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合物，且并未單獨(dú)對(duì)肝素酶Ⅱ的生產(chǎn)進(jìn)行研究。Lohse等[8]從肝素黃桿菌發(fā)酵的混合肝素酶液中經(jīng)多步純化制備出肝素酶Ⅱ，但回收率僅有1.02%。此外研究人員主要通過改變?nèi)诤喜呗詠砗?jiǎn)化肝素酶Ⅱ的純化步驟以期達(dá)成肝素酶Ⅱ的可溶性表達(dá)，提高酶活和收率。Su等[9]將肝素酶Ⅱ基因Hep B克隆，并在大腸桿菌中重組表達(dá)，結(jié)果表明肝素酶Ⅱ易形成包涵體，且包涵體所占的比例在37–25℃隨著溫度的降低而下降。傅文彬等[10]將Hep B插入質(zhì)粒pET24a中構(gòu)建重組菌，低溫20℃成功誘導(dǎo)表達(dá)了帶有組氨酸標(biāo)簽的融合肝素酶Ⅱ，但該過程中也易形成包涵體，可溶性表達(dá)量不高，酶活僅為50 U/L。Blain等[11]將肝素酶Ⅱ的基因插入到肝素酶Ⅰ調(diào)節(jié)區(qū)的下游，整合得到全新的轉(zhuǎn)化子菌株，結(jié)果表明，在新的表達(dá)體系中肝素酶Ⅱ的表達(dá)量提高了5倍。邢新會(huì)等[12]將HepⅡ與MBP融合并在宿主TB1實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳中融合蛋白呈單一條帶，但酶活仍不高，僅為118.4 IU/L。總體而言，目前對(duì)肝素酶Ⅱ的生產(chǎn)研究仍較少，且據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)量仍偏低。

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了重組基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET19b-HepⅡ，該菌株能可溶性表達(dá)帶有組氨酸標(biāo)簽的 HepⅡ(His-HepⅡ)，酶活可達(dá)180 U/L。為進(jìn)一步提高肝素酶Ⅱ的可溶性表達(dá)，實(shí)現(xiàn)肝素酶Ⅱ產(chǎn)量和酶活的提高，現(xiàn)以此工程菌為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)其誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，并將該條件應(yīng)用到高密度發(fā)酵中，以實(shí)現(xiàn)His-HepⅡ產(chǎn)量和酶活的大幅度提高，為HepⅡ的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組工程菌E.coli BL21(DE3)-pET19b-HepⅡ由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建；利用基因工程手段PCR擴(kuò)增出肝素酶Ⅱ基因Hep B，再將其插入pET19b質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)E.coli BL21(DE3)，構(gòu)建重組工程菌。

實(shí)驗(yàn)中確定誘導(dǎo)條件所用培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基[13]，高密度發(fā)酵培養(yǎng)基為R培養(yǎng)基[13]。

R培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀13.5 g/L，檸檬酸1.7 g/L，微量金屬離子溶液10 mL/L，七水硫酸鎂1.4 g/L，賴氨酸2 mg/L，加合適的碳源與氮源，調(diào)節(jié)pH值至7.0。

微量金屬離子溶液(g/L)：七水硫酸鐵10，二水氯化鈣2，七水硫酸鋅2.2，四水硫酸錳0.5，五水硫酸銅1，四水合鉬酸銨0.1，四硼酸鈉0.02，用5 mol/L HCl溶解。

1.2 方法

1.2.1 種子活化

將保存菌種按1%的量接種至10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，加氨芐青霉素至終濃度為50 μg/mL,37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵

將活化后菌種按1%的接種量接種至100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，加氨芐青霉素至終濃度為50 μg/mL，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，取不同時(shí)間段培養(yǎng)液測(cè)定菌體濃度OD600，確定生長(zhǎng)曲線。在對(duì)數(shù)期間內(nèi)加入IPTG低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時(shí)間，取菌液測(cè)定OD600，離心破碎測(cè)定酶活。

1.2.3 發(fā)酵罐發(fā)酵

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用X2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5 L發(fā)酵罐 (上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中裝入2.0 L培養(yǎng)基，接種100 mL培養(yǎng)過夜的搖瓶培養(yǎng)液，加氨芐青霉素至終濃度為50 μg/mL，37℃發(fā)酵，初始轉(zhuǎn)速600 r/min，初始通氣流量為3 L/min，隨著菌體OD600值而增加轉(zhuǎn)速與通氣流量，以維持溶氧值達(dá)20%以上。采用DO-Start模式[14]來流加500 g/L的葡萄糖與20 g/L的MgSO4·7H2O混合液，用28%氨水、1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值使其穩(wěn)定在7.0。

1.2.4 酶活測(cè)定

酶活檢測(cè)采用UV232法[15]。在1 mL緩沖液(50 mmol/L醋酸鈉，5 mg/mL的肝素，pH 7.3)中加入50 μL粗酶液，于30℃水浴中反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后立即置100℃水浴中終止反應(yīng)，12 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)232 nm處吸光值。計(jì)算公式：

A232為232 nm處測(cè)定的紫外吸收值，V1為反應(yīng)液的總體積；V2為加入酶液的體積；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；根據(jù)酶活力定義：一個(gè)酶活力單位是指30℃、pH 7.0的條件下，在1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μmol具有△4,5不飽和糖醛酸鍵的寡糖片段的酶量，該△4,5不飽和糖醛酸寡糖片段的摩爾消光系數(shù)為5 500，生成物為1 μmol不飽和糖醛酸所需要的酶量為一個(gè)活力單位，所以吸光系數(shù)經(jīng)過換算為5.5(μmol/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2.1.1 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該重組菌對(duì)數(shù)期OD600在0.5–3.8之間。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的幾個(gè)不同時(shí)期(OD600分別為 0.747、1.612、2.426、3.624)，降溫至20℃，分別加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.25 g/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，檢測(cè)菌體濃度并測(cè)定酶活。結(jié)果如圖1A所示，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期誘導(dǎo)后酶活最高，此時(shí)菌體生長(zhǎng)代謝旺盛，蛋白大量合成表達(dá)，外源蛋白也易于誘導(dǎo)表達(dá)，若誘導(dǎo)太晚，則菌體代謝開始降低，不利于外源蛋白的表達(dá)[16]。

2.1.2 誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響

此重組菌表達(dá)系統(tǒng)上帶有乳糖基因(lac)啟動(dòng)子，需要IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。當(dāng)菌體濃度OD600為0.74時(shí)，分別加入不同量的誘導(dǎo)劑IPTG，20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，檢測(cè)菌體濃度并測(cè)定酶活。如圖1B所示，隨著IPTG濃度的增加，誘導(dǎo)結(jié)束后菌體的濃度OD600有略微的下降，表明IPTG對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。此外，IPTG濃度較低時(shí)，外源蛋白的表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)劑濃度的升高而不斷升高；當(dāng)濃度超過一 定限度時(shí)，蛋白表達(dá)水平又會(huì)受到影響。

圖1 不同誘導(dǎo)條件下重組菌株搖瓶產(chǎn)酶的酶活及菌體濃度變化Fig.1 Enzymatic activity of His-HepⅡand cell growth in flask culture of recombinant E.coli under different induction conditions.(A)Enzymatic activity and cell growth under different initial induction OD600.(B)Enzymatic activity and cell growth under different IPTG final concentration.(C)Enzymatic activity under different induction temperature.(D)Cell growth under different induction temperature.

2.1.3 誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響

重組菌的誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間相關(guān)聯(lián)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響進(jìn)行了綜合考察。培養(yǎng)菌體濃度OD600為0.6–0.8，添加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.3 g/L，分別于16℃、20℃、24℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6–12 h，檢測(cè)菌體濃度并測(cè)酶活。由圖1C與1D可見，16℃下誘導(dǎo)不利于菌體生長(zhǎng)，酶活也較低；20℃下誘導(dǎo)10 h酶活最高，為570 U/L；24℃下誘導(dǎo)8 h酶活較高，但酶活仍低于20℃下誘導(dǎo)的最高酶活?？梢娚邷囟扔欣诰w的生長(zhǎng)代謝，而適度的低溫有利于外源蛋白的可溶性表達(dá)，針對(duì)不同的目標(biāo)采用不同的培養(yǎng)手段，有利于發(fā)酵水平的提高和發(fā)酵周期的縮短。

通過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)37℃培養(yǎng)重組菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，降溫至20℃，添加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.3 g/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，酶活可達(dá)570 U/L，相比未優(yōu)化前提高2倍多。

2.2 R培養(yǎng)基最佳碳氮源優(yōu)化

高密度發(fā)酵是一種通過提高單位體積菌體密度從而提高重組酶的產(chǎn)量與酶活，降低生產(chǎn)成本的發(fā)酵方式[16]。本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究基礎(chǔ)上，選用R培養(yǎng)基作為高密度發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以高菌體濃度與高酶活為目標(biāo)，考察R培養(yǎng)基中不同碳源和氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)量及酶活的影響。

2.2.1 碳源優(yōu)化

分別以5–15 g/L的葡萄糖、蔗糖、甘油作為碳源，其他成分與R發(fā)酵培養(yǎng)基相同，采用以上優(yōu)化的誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)酶。其中以15 g/L的葡萄糖、10 g/L的甘油、15 g/L的蔗糖作為碳源時(shí)菌體生長(zhǎng)最好 (圖2A)，且上述3種碳源培養(yǎng)菌體誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活分別為984 U/L、754 U/L和467 U/L。由此可見，葡萄糖組具有生長(zhǎng)時(shí)間短，菌體濃度高，酶活表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，故選取葡萄糖為后續(xù)發(fā)酵罐培養(yǎng)碳源。

圖2 R培養(yǎng)基中發(fā)酵優(yōu)化Fig.2 Optimization of fermentation in R medium.(A)Carbon source.(B)Nitrogen source.(C)High cell density fermentation.

2.2.2 氮源優(yōu)化

分別以7.6 g/L硝酸鈉、5.0 g/L氯化銨、6.0 g/L硫酸銨、6.0 g/L磷酸氫二銨作為培養(yǎng)基氮源 (4種氮源中所含氮量相同，均為1.25 g/L)，采用以上優(yōu)化的條件進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。其中以磷酸氫二銨作為氮源時(shí)菌體濃度最高 (圖2B)，且上述4種氮源培養(yǎng)菌體誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活分別為336 U/L、774 U/L、825 U/L和986 U/L，故取磷酸氫二銨為后續(xù)發(fā)酵罐培養(yǎng)碳源。

2.3 優(yōu)化條件下重組菌的發(fā)酵罐高密度發(fā)酵

將LB培養(yǎng)基中最佳產(chǎn)酶條件與R培養(yǎng)基中最佳碳氮源優(yōu)化結(jié)果相結(jié)合，進(jìn)行發(fā)酵罐高密度發(fā)酵。37℃培養(yǎng)菌體13 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，其OD600為50.5左右時(shí)，降低發(fā)酵液溫度至20℃后，加入IPTG至終濃度0.3 g/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間測(cè)量菌體濃度并測(cè)酶活。結(jié)果如圖2C所示：誘導(dǎo)初期，重組菌適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境，生長(zhǎng)緩慢，但菌體已開始誘導(dǎo)產(chǎn)酶，酶活性有較大的增加；誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后，重組菌生長(zhǎng)速度加快，酶活性增加的速度也加快；誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h后，菌體濃度與酶活值均達(dá)到最高，菌體濃度OD600為98，比搖瓶發(fā)酵菌體濃度提高了近21倍，酶活為9 436 U/L，比搖瓶發(fā)酵提高了近16倍，酶活得到大幅提高，但相對(duì)單位菌體來說酶活有一定的降低?？赡茉蚴歉呙芏劝l(fā)酵過程中積累了一些抑制重組菌外源蛋白表達(dá)的有害代謝物，如乙酸[17-18]。乙酸的產(chǎn)生與細(xì)胞中電子傳遞和三羧酸循環(huán)有關(guān)，高密度發(fā)酵比生長(zhǎng)速率高，重組菌通過氧化代謝產(chǎn)生的能量不能滿足菌體合成與異化作用的需求，必須通過乙酸生成途徑提供能量及相關(guān)酶，乙酸的過多積累會(huì)影響外源蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致單位菌體酶活降低。

3 結(jié)論

文中在搖瓶體系中對(duì)黃桿菌肝素酶Ⅱ重組菌的誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了重組菌的發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)，菌體濃度和酶活較搖瓶發(fā)酵分別提高了21倍和16倍，達(dá)到了較高的生產(chǎn)水準(zhǔn)。該研究為HepⅡ的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。

[1]Ranga G,Ram S.A comparative analysis of theprimary sequences and characteristics of Heparinases I,II,and III from Flavobacterium heparinum.Biochem Biophys Res Commun,1996,229(3):770–777.

[2]Garg HG,Cindhuchao N,Quinn DA,et al.Heparin oligo-saccharide sequence and size essential for inhibition of pulmonary artery smooth muscle cell proliferation.Carbohydr Res,2002,337(21–23):2359–2364.

[3]Sasisekharan R,Moses MA,Nugent MA,et al.Heparinase inhibits neovascularization.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(4):1524–1528.

[4]Liu DF,Kevin P,Zachary S,et al.Use of heparinase III in cancer treatment and inhibition of tumor cell growth:WO,2001066772.2001-09-13.

[5]Hirsh J,AnandSS,Halperin JL,etal.Guideto anticoagulant therapy:heparin.Circulation,2001,103(24):2994–3018.

[6]Galliher PM,Cooney CL,Langer R,et al.Heparinase production by Flavobacterium heparinum.Appl Environ Microbiol,1981,41(2):360–365.

[7]Galliher PM,Linhardt RJ,Conway LJ,et al.Regulation of heparinase synthesis in Flavobacterium heparinum.Appl Microbiol Biotechnology,1982,15(4):252–257.

[8]Lohse DL,Linhardt RJ.Purification and characterication of heparin lyases from Flavobacterium heparinum.J Biol Chem,1992,267(34):24347–24355.

[9]Su H,Blain F,Musil RA,et al.Isolation and expression in Escherichia coli of hepB and hepC,genes coding for the glycosaminoglycan-degrading enzymes heparnaseⅡand heparinase III, respectively, from Flavobacterium heparinum. Appl Environ Bacteriol, 1996, 62(8):2723–2734.

[10]Fu WB,Yu X,Zhao J,et al.Cloning and expression of Flavobacteriunheparinum HeparinaseⅡ.Food Drug,2007,9(3):1–4(in Chinese).傅文彬,余曉,趙健,等.黃桿菌肝素酶Ⅱ的克隆與表達(dá).食品與藥物,2007,9(3):1–4.

[11]Blain F,Tkalec AL,Su H,et al.Expression system for high levels of GAG lyase gene expression and study of the hepA upstream region in Flavobacterium heparinum.J Bacteriol,2002,184(12):3242–3252.

[12]Xing XH,Li Y,Ye FC,et al.A method of heparinasesⅡfusion protein coding gene and expression: CN,201010259905.2010-08-20(in Chinese).邢新會(huì),李曄,葉逢春,等.一種肝素酶Ⅱ融合蛋白及其編碼基因與表達(dá)方法:CN,201010259905.2010-08-20.

[13]Liu Y,Chen JH,Chen J,et al.Effects of carbon sources and feeding strategieson heparosan production by Escherichia coli K5.Bioprocess Biosyst Eng,2012,35(7):1209–1218.

[14]Ram S,Mark B,Kelley WM,et al.Cloning and expression of heparinase I gene from Flavobacterium heparinum.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(8):3660–3664.

[15]Dae-Hyuk K,Nam SH,Kyung-Moo P,etal.Overproduction of Phytolacca insularis protein in batch and fed-batch of recombinant Escherichia coli.Process Biochem,2001,36(1):537–542.

[16]Shiloach J,Fass R.Growing E.coli to high cell density—a historical perspective on method development.Biotechnol Adv,2005,23(5):345–357.

[17]Lee SY.High cell-density culture of Escherichia coli.Trends Biotechnol,1996,14(3):98–105.

[18]Han K,Lim HC,Hong J.Acetic acid formation in Escherichia coli fermentation.Biotechnol Bioeng,1992,39(6):663–671.