鼠腦驅(qū)動蛋白ATP水解機制的晶體學分析

萬群，祝娉婷，呂后寧，陳欣虹

揚州大學醫(yī)學院生化系，揚州 江蘇 225001

常規(guī)驅(qū)動蛋白在細胞器 (Organelle) 和囊泡 (Vesicle) 的運輸中起著重要的作用[1-2]。了解常規(guī)驅(qū)動蛋白的結(jié)構(gòu)將有助于對它的運輸功能的深入理解。以往的研究表明，它的頭部由兩個馬達區(qū)域 (Motor domain) 構(gòu)成，并結(jié)合在微管系統(tǒng)上。尾部和將要轉(zhuǎn)移的細胞器或囊泡結(jié)合。頸和軀干則將頭尾分開[2]。常規(guī)驅(qū)動蛋白的馬達區(qū)域利用ATP水解釋放的能量采用雙手交替模式 (Hand-over-hand mechanism) 沿微管系統(tǒng)高度連續(xù)性地運動[3]：一個頭處于ADP結(jié)合狀態(tài)，同微管分開。另一個頭處于 ATP或ADP·Pi狀態(tài)，同微管緊密結(jié)合。當ATP水解并釋放出Pi后，這個頭部離開微管。同時另一個頭部的ADP被ATP取代，并結(jié)合到微管上去。理解ATP中儲存的化學能是如何連續(xù)轉(zhuǎn)化為機械動能的機制是研究常規(guī)驅(qū)動蛋白功能的重要課題。獲得馬達區(qū)域同ATP結(jié)構(gòu)類似物復合物和ADP復合物的晶體結(jié)構(gòu)能在原子水平了解上述功能。

鼠腦驅(qū)動蛋白是典型的常規(guī)驅(qū)動蛋白[4]。早在1997年它的馬達區(qū)域同ADP復合物的晶體結(jié)構(gòu)就已經(jīng)發(fā)表[5]。但是直到現(xiàn)在，它同ATP結(jié)構(gòu)類似物的復合物晶體一直未能得到。研究以鼠腦驅(qū)動蛋白為代表的常規(guī)驅(qū)動蛋白的ATP水解機制和化學能與機械能互換的機理就成為一個難點。本文作者將鼠腦驅(qū)動蛋白的馬達區(qū)域在硫酸銨中沉淀結(jié)晶后，在酒石酸鉀鈉 (Sodium potassium tartrate) 中浸泡去除硫酸根離子，再將 ATP的結(jié)構(gòu)類似物AMPPNP浸泡入活性中心，從而得到驅(qū)動蛋白同AMPPNP復合物的晶體結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果同以往的驅(qū)動蛋白·ADP復合物晶體結(jié)構(gòu)的比較揭示了開關(guān)區(qū)域Ⅱ的Glu237起連接ATP的γ-磷酸和驅(qū)動蛋白微管結(jié)合區(qū)的樞紐作用。

1 材料與方法

1 試劑

陰離子交換樹脂 Mono Q HR5/5購自美國Pharmacia公司。高氯酸 (Perchloric acid)、三乙胺碳酸氫鹽 (Triethylammonium hydrogen bicarbonate)、酒石酸鉀鈉 (Sodium potassium tartrate)、對二氮己環(huán)-1,4-二(2-乙磺酸)(Piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid), Pipes)緩沖液、Bradford試劑、BSA標準蛋白等試劑購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 腺苷酸的分析和純化

結(jié)合在驅(qū)動蛋白中的腺苷酸采用陰離子交換色譜來分析[6]。約 4 nmol (100 mL，40 mmol/L)的驅(qū)動蛋白用 100 mL 10%三乙胺碳酸氫鹽變性，從而釋放出結(jié)合的核苷酸。變性蛋白以321 000′g的離心力20 min離心去除后，上清液加入40 mL中和液 (4 mol/L醋酸鉀，10 mol/L氫氧化鉀) 將 pH 調(diào)到 5–6。321 000′g離心20 min去除沉淀后，上清液加樣到1 mL Mono Q陰離子交換柱。核苷酸用0?0.5 mol/L乙胺碳酸氫鹽梯度洗脫。用標準濃度的不同核苷酸(ADP、AMP、ATP、AMPPNP、AMPPCP、ATPgS)在Mono Q陰離子交換柱洗脫后作為對照，可以對腺苷酸進行定性和定量。

ATP及其結(jié)構(gòu)類似物 Adenylylimidodiphosphate (AMPPNP) 和 Adenosine 5′-[γ-thio]triphosphate (ATPgS) 含有少量的 ADP殘余。由于ADP的親和力比AMPPNP和ATPgS高，ADP必須從中去除，否則將影響上述結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合 (詳見下文)。AMPPNP、ATPg和ATP的純化過程同上述分析過程類似，但是核苷酸的加樣量提高為 4 mmol，洗脫劑為0?1 mol/L三乙胺碳酸氫鹽。純化的腺苷酸用凍干機在–40 ℃真空干燥，保存在–80 ℃冰箱備用。

1.2.2 驅(qū)動蛋白的結(jié)晶

野生型驅(qū)動蛋白以懸滴法在 18 ℃結(jié)晶：1 mL 蛋白溶液 (10 mg/mL 驅(qū)動蛋白、50 mmol/L Pipes緩沖液、500 mmol/L 氯化鈉、5 mmol/L 氯化鎂)同 1 mL 池液 (1.7 M/L 硫酸銨、500 mmol/L 氯化鈉、20% (V/V) 甘油) 混合后與1 mL池液在封閉的環(huán)境下平衡。突變體E237A的懸滴法結(jié)晶條件如下：1 mL蛋白溶液(18 mg/mL 驅(qū)動蛋白、50 mmol/L Pipes緩沖液、500 mmol/L 氯化鈉、5 mmol/L 氯化鎂) 同 1 mL池液 (1.9 mol/L 硫酸鋰、500 mmol/L 氯化鈉)混合后，與1 mL池液在封閉的環(huán)境下平衡。

1.2.3 在酒石酸鉀鈉穩(wěn)定液中浸泡 ATP結(jié)構(gòu)類似物

將晶體從結(jié)晶溶液中撈出，浸泡在10 mL酒石酸鉀鈉穩(wěn)定液[7-8](2.0 mol/L 酒石酸鉀鈉、30%甘油、120 mmol/L 氯化鎂、77 mmol/L Pipes緩沖液) 中1 h，重復浸泡2次，最后再浸泡在含100 mmol/L ATP結(jié)構(gòu)類似物的酒石酸鉀鈉穩(wěn)定液中1 h。將晶體撈出，快速冷凍在液氮中。

1.2.4 晶體衍射數(shù)據(jù)的收集和處理

將驅(qū)動蛋白晶體從結(jié)晶溶液撈出后，立即在液氮中快速冷凍。由于結(jié)晶溶液中含 20%甘油作為冷凍保護劑 (Cryoprotectant)，冷凍的晶體周圍不會有冰晶形成。驅(qū)動蛋白同ADP的復合物晶體衍射數(shù)據(jù)由 Rigaku RUH3R發(fā)生器和Mar345成像板構(gòu)成的X-光衍射儀收集，其他復合物晶體衍射數(shù)據(jù)在上海同步輻射光源 (SSRF)光束線 BL17U1收集。所有數(shù)據(jù)用 HKL2000[9]軟件處理。

1.2.5 晶體結(jié)構(gòu)解析和展示

晶體結(jié)構(gòu)解析以2kin.pdb[5]為模板，事先去除蛋白本身以外的所有分子，包括配體、水分子和離子。然后用 Phaser程序中的分子置換(Molecular replacement) 方法得到初始的結(jié)構(gòu)[10]，最后用 CNS 程序[11]進行結(jié)構(gòu)精算(Structure refinement) 和用 coot程序[11-12]對模型進行調(diào)整 (Model building)。晶體結(jié)構(gòu)以Pymol程序[13]展示。

1.2.6 晶體結(jié)構(gòu)的細微差別的分析

由于晶體浸泡后的晶胞參數(shù)和結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生大的變化，蛋白與不同腺苷酸的復合物的晶體結(jié)構(gòu)變化用同構(gòu)差別圖 (Isomorphous difference map)[14]來分析。在圖中，紅色表示電子云密度減小，綠色表示電子云密度增強。如果在蛋白模型附近同時有紅色和綠色的變化，則表示蛋白的這段區(qū)域從紅色區(qū)域向綠色區(qū)域移動。圖中信號強度為3倍背景強度 (3s)。同構(gòu)差別圖用以下公式在CNS程序中生成：

注：DpobsF,是浸泡處理的晶體的結(jié)構(gòu)因子的幅度 (Structural factor amplitude)，F(xiàn)obs,p是沒有處理的晶體的結(jié)構(gòu)因子的幅度，calcp,F是無處理晶體的結(jié)構(gòu)因子的相。

1.2.7 基礎(chǔ)ATPase酶活 (Basal ATPase) 的測定

無微管激活時的驅(qū)動蛋白基礎(chǔ)ATPase酶活(Basal ATPase activity) 用鉬酸銨/硫酸亞鐵混合液來測定在反應中釋放的磷酸離子來測定[15]。具體過程如下：在 25 ℃將 2 mmol/L ATP和5 mmol/L MgCl2加入到 400 mL 含 0.3 mg/mL 驅(qū)動蛋白的反應液中。每10 min，從中取出50 mL反應液，混入50 mL滅活液 (140 mmol/L EDTA,20% SDS, pH 6.5)。200 mL 顯色液 (2% 鉬酸銨，0.5% 硫酸亞鐵) 繼而加入到上述混合液中，在25 ℃放置20 min顯色。最后，已顯色的溶液測定 OD700。用無機磷酸在鉬酸銨/硫酸亞鐵混合液中的 OD700值作出光吸收標準曲線后，ATP的水解速率 (r) 可以通過以下方程計算：

(注：OD/min是顯色反應速率；nmols/OD是無機磷酸在鉬酸銨/硫酸亞鐵試劑中的標準曲線斜率；MW 是蛋白的分子量；對于 rK354，b值為1.68。)

2 結(jié)果與分析

2.1 驅(qū)動蛋白用硫酸銨結(jié)晶后的晶體結(jié)構(gòu)

驅(qū)動蛋白和ADP的復合物用硫酸銨代替文獻報道的硫酸鋰[5]為沉淀劑結(jié)晶后，晶體分辨率可以達到2.0 ? (表1)。它的總體結(jié)構(gòu)同文獻報道的 (2kin.pdb) 非常類似 (圖1)：將二者的主鏈Ca原子重疊后，均方根偏差 (Root mean square deviation，RMSD)只有0.59 ?。鎂離子結(jié)合在由ADP 的b-phosphate、開關(guān)區(qū)域Ⅰ(SwitchⅠ)、開關(guān)區(qū)域Ⅱ (SwitchⅡ) 和磷酸結(jié)合環(huán)線(Phosphate-binding loop, P-loop) 組成的空洞中。鎂離子的存在使得活性中心更加緊湊，有助于ADP結(jié)合在活性中心。新的晶體結(jié)構(gòu)在3個局部區(qū)域同 2kin.pdb有所不同：a0螺旋 (氨基酸序列 18-28)、Loop 6 (氨基酸序列 121?129)、Loop 12 (氨基酸序列271?282)。這些不同是由于晶格排列 (Crystal packing) 在兩種結(jié)晶條件下不同造成的。在硫酸銨條件下，位于腺嘌呤結(jié)合域的精氨酸14殘基同晶格中鄰近分子的谷氨酸125殘基形成一個離子鍵 (3.2 ?)。該離子鍵起到懸臂效應，將a0螺旋抬高而遠離腺苷酸(圖2)。在硫酸鋰條件下，上述兩個氨基酸殘基的距離為10.6 ?，無法形成離子鍵，使得a0螺旋和Loop 6可以互相靠近，這樣活性中心就顯得更緊湊。在硫酸鋰條件下，Loop 12中的組氨酸 276殘基在晶格中與附近一個分子的位于b1A折疊的谷氨酸 179殘基形成一個氫鍵(2.7 ?)。而此氫鍵在硫酸銨條件中不存在。總之，晶格排列的不同使得a0螺旋、Loop 6和Loop 12的構(gòu)象在硫酸銨結(jié)晶條件下與硫酸鋰結(jié)晶條件下有所不同。

圖1 驅(qū)動蛋白單體的晶體結(jié)構(gòu)Fig. 1 Crystal Structure of the monomeric kinesin.ADP: blue; Switch I: cyan; Switch II: yellow; P-loop:magenta; the microtubule-binding region: salmon.

表1 晶體衍射和結(jié)構(gòu)精修Table 1 Data collection and refinement statistics

圖2 兩種結(jié)晶條件下驅(qū)動蛋白結(jié)構(gòu)的比較Fig. 2 Structural comparison between the two crystallization conditions. (A) The superposition of the crystal structures in the (NH4)2SO4 condition (cyan) and the Li2SO4 condition (magenta). (B) In the (NH4)2SO4 condition, there is a salt bridge between Arg14 and Glu125 in a neighboring molecule. The salt bridge may have a cantilever force to pull the a0 helix away from the nucleotide to open the pocket.

圖3 硫酸銨結(jié)晶條件下活性中心的分析Fig. 3 Structural analysis in the active site of the (NH4)2SO4 condition. (A) The residual Fo-Fc electron density map shows a tightly bound SO42-. (B) The isomorphous difference map of the SO42- bound state vs. the ADP bound state. There are no changes in the b-phosphate position because the SO42- is there. There is much less electron density in the AMP and Mg2+ positions.

當結(jié)晶溶液不包含游離的ADP時，殘余Fo-Fc電子云密度圖 (Residual Fo-Fc electron density map) 顯示，在原先 ADP的b-磷酸的位置，結(jié)合著一個硫酸根離子 (圖3A)。對只結(jié)合硫酸根的晶體和結(jié)合 ADP的晶體進行比較，同構(gòu)差別圖(Fobs，SO4– Fobs，ADP) 顯示前者晶體的活性中心的b-磷酸位置電子云密度無差別，而其他位置 (包括鎂離子和AMP的位置) 電子云密度大大降低 (圖3B)。以上結(jié)果表明，在硫酸銨條件下，如果沒有游離腺苷酸，晶體活性中心只結(jié)合了一個硫酸根離子。而在硫酸鋰條件下，即使沒有游離的腺苷酸，晶體活性中心仍然結(jié)合著ADP[5]。這表明，ADP的親和力在硫酸銨條件下長出的晶體中比在硫酸鋰條件下長出的晶體中要小。這可能是在硫酸鋰條件下，晶格中一個鄰近分子的谷氨酸125位于ADP的右下方 (圖4A)。這個谷氨酸殘基的OE1原子和OE2原子同ADP中核糖部分的2￠-位羥基分別形成了距離為3.5 ?和3.6 ?的兩個氫鍵。雖然這兩個氫鍵的距離比較遠，但谷氨酸125的羧基由于共軛效應具有電負性，因此這兩個氫鍵對ADP的結(jié)合力仍然有貢獻。而在硫酸銨條件下，由于晶格排列的不同，上述氫鍵不存在：谷氨酸125的OE1原子同ADP中核糖部分的 2￠-位羥基距離為 6.7 ?，不能形成氫鍵(圖 4B)。

圖4 在兩種結(jié)晶條件下晶格排列的比較Fig. 4 Crystal packing analysis between the two different crystallization conditions. (A) In the Li2SO4 condition,Glu125 in the neighboring molecule is located at the bottom left. The centering molecule: magenta. The neighboring molecule: pink. Glu125 in the neighboring molecule: green. ADP: blue. (B) In the (NH4)2SO4 condition, Glu125 in the neighboring molecule is located at the bottom right. The centering molecule: cyan. The neighboring molecule:light blue. Glu125 in the neighboring molecule, green. ADP: blue.

2.2 結(jié)合在活性中心的硫酸離子的去除

雖然在無游離ADP時，新的結(jié)晶條件下得到的晶體只有硫酸根離子結(jié)合在活性中心，但是ATP的結(jié)構(gòu)類似物AMPPNP仍然不能被浸泡入活性中心。這可能是由于硫酸根離子在P-loop位點結(jié)合的強度非常高，不能被AMPPNP取代。為此，一個不含硫酸根的酒石酸鉀鈉穩(wěn)定液 (2.0 mol/L 酒石酸鉀鈉、30% 甘油、120 mmol/L 氯化鎂、77 mmol/L Pipes緩沖液) 被用來去除結(jié)合在活性中心的硫酸根離子。這種緩沖液含 30%甘油，可以使晶體免遭破壞 (圖5)。當硫酸離子被去除后，AMPPNP就被成功地浸泡入晶體的活性中心 (圖6A)。

2.3 在不同腺苷酸結(jié)合狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)的比較

驅(qū)動蛋白晶體經(jīng)過酒石酸鉀鈉浸泡去除硫酸離子后，再分別浸泡加入AMPPNP和ADP。對 AMPPNP和 ADP結(jié)合狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)重疊比較后發(fā)現(xiàn)，這兩者的總體結(jié)構(gòu)沒有太大的變化：均方根偏差只有 0.34 ?。但是同構(gòu)差別圖(Fobs,AMPPNP– Fobs,ADP)顯示 (圖 6)，P-loop 中的蘇氨酸88殘基被AMPPNP中的g-磷酸推開。開關(guān)區(qū)域Ⅰ(氨基酸序列 200–206) 和開關(guān)區(qū)域Ⅱ (氨基酸序列 231–236) 被g-磷酸吸引。位于開關(guān)區(qū)域Ⅰ附近的微管結(jié)合區(qū)域Ⅰ(MTⅠ，氨基酸序列139–147) 也移向g-磷酸。但是位于開關(guān)區(qū)域Ⅱ附近的微管結(jié)合區(qū)域，例如a4螺旋區(qū)，沒有明顯變化。將活性中心的關(guān)鍵氨基酸殘基和 AMPPPNP不包括在模型中，對結(jié)構(gòu)精修后得到的殘余 Fo-Fc 圖 (Residual Fo – Fc map) 顯示 (圖 7)，開關(guān)區(qū)域Ⅰ的精氨酸 204殘基同谷氨酸200殘基形成一個離子鍵 (3.2 ?)。開關(guān)區(qū)域Ⅱ的谷氨酸237殘基處于無序狀態(tài) (Disorder)而不與精氨酸204殘基形成離子鍵。ADP狀態(tài)下的殘余 Fo-Fc圖顯示，精氨酸 204同谷氨酸200形成離子鍵 (3.5 ?)。而ADP狀態(tài)下的谷氨酸 237雖然清晰可見，但是與精氨酸204距離太遠 (7.2 ?)，不能形成離子鍵。

2.4 點突變體E237A的微管結(jié)合區(qū)域的顯著變化

位于開關(guān)區(qū)域Ⅱ的谷氨酸 237在驅(qū)動蛋白中非常保守。以往文獻認為谷氨酸 237殘基同精氨酸204殘基在ATP結(jié)合時會形成一個離子鍵[16-18]。但是，在硫酸銨結(jié)晶條件下，驅(qū)動蛋白-AMPPNP復合物晶體結(jié)構(gòu)表明，這個離子鍵并不存在。為了闡明谷氨酸 237的作用，它被突變?yōu)楸彼?(E237A)。實驗表明，鼠腦驅(qū)動蛋白突變體E237A的基礎(chǔ)ATPase酶活與野生型相比沒有顯著的變化 (表2)。

圖 5 硫酸根離子從酒石酸鉀鈉穩(wěn)定液中去除后的效果Fig. 5 Effect of sulfate removal from a tartrate stabilizing solution. Addition of 30% glycerol is important to preserve the crystal quality.

圖6 同構(gòu)差別圖(Fobs,AMPPNP – Fobs,ADP)Fig. 6 Isomorphous difference map (Fobs,AMPPNP – Fobs,ADP). (A) Both SwitchⅠand Ⅱ were attracted towards theg-phosphate. However, only the conformational changes in the SwitchⅠwere propagated to the microtubule binding regionⅠ(MTⅠ). (B) The zoom-in map in the catalytically active site. Thr88 in the P-loop was pushed away by theg-phosphate. E237 was disordered.

圖7 在AMPPNP和ADP狀態(tài)下離子鍵形成的分析Fig. 7 Salt bridge analysis between the AMPPNP state and the ADP state in the tartrate stabilizing solution. (A) In the residual Fo-Fc map of the AMPPNP state, Glu237 is disordered. There is a salt bridge between Glu200 and Arg204. (B)In the residual Fo-Fc map of the ADP state, though E237 is ordered, it is too far away (7.2 ?) to form a salt bridge with Arg204.

表2 驅(qū)動蛋白對不同核苷酸的基礎(chǔ)水解活性Table 2 Basal ATPase activity for the different nucleotides

圖8 微管結(jié)合區(qū)域Ⅱ在谷氨酸237突變?yōu)楸彼岷蟮慕Y(jié)構(gòu)差異Fig. 8 Significant changes in the E237A mutant in the microtubule-ding region Ⅱ region. (A) The superposition of the wild type and E237 structures. (B) In E237A, the main chain of A237 rotated 134° to form a H-bond with Thr88. (C)In the wild type crystal obtained from the Li2SO4 condition, Glu237 side chain formed two H-bonds with Thr88 and one salt bridge with Arg204.

E237A與ADP復合物的晶體結(jié)構(gòu)與文獻報道的野生型晶體結(jié)構(gòu) (2kin.pdb) 總體相似 (均方根偏差只有0.68 ?)。但是，在微管結(jié)合區(qū)域Ⅱ有非常顯著的差別 (圖 8)：開關(guān)區(qū)域Ⅱ中的A237以后序列的氨基酸移到不同的位置；Loop 11和Loop 12變得更無序；a4螺旋和a5螺旋轉(zhuǎn)移了 1.2 ?。在野生型晶體中 (Li2SO4條件下)，谷氨酸237殘基同P-loop的蘇氨酸88形成兩個氫鍵 (2.7 ?和2.8 ?) 以及同開關(guān)區(qū)域Ⅰ的精氨酸204形成一個離子鍵 (3.1 ?)。當谷氨酸237被突變?yōu)楸彼岷螅渲麈溞D(zhuǎn)了134度，從而與蘇氨酸88主鏈形成一個氫鍵 (2.7 ?)。為了同這種變化保存一致，在此突變后的微管結(jié)合區(qū)域Ⅱ (Loop 11、Loop 12、a4折疊和a5折疊) 都發(fā)生了顯著的變化。精氨酸 204不能同丙氨酸237形成離子鍵，但是它的殘基同谷氨酸200形成了一個離子鍵 (3.1 ?)。

3 討論

AMPPNP、ATPgS和 AMPPCP都是常用的ATP結(jié)構(gòu)類似物。ATPgS中連接g-phosphate和b-phosphate的原子和ATP一樣，都是氧原子。ATPgS能被驅(qū)動蛋白快速水解，晶體結(jié)構(gòu)中最終只包含ADP (表2)。因此，它不是驅(qū)動蛋白晶體結(jié)構(gòu)研究中的理想ATP結(jié)構(gòu)類似物。AMPPCP中連接g-phosphate和b-phosphate的是碳原子。碳原子的電負性比氧原子小很多，而且P-C-P鍵同ATP中的 P-O-P鍵差別較大。由于這種大的差異，AMPPCP也不是理想的ATP結(jié)構(gòu)類似物。AMPPNP中連接g-phosphate和b-phosphate的氮原子電負性同氧原子接近，而且P-N-P鍵同ATP中的P-O-P鍵差別小。因此，AMPPNP是ATP的理想結(jié)構(gòu)類似物[19-20](圖9)。

圖9 幾種ATP結(jié)構(gòu)類似物的比較Fig. 9 Structural comparison among a few ATP analogs.

驅(qū)動蛋白晶體在含AMPPNP的酒石酸鉀鈉穩(wěn)定液中浸泡后，在活性中心可以清楚地看到g-phosphate (圖 7A)，并吸引開關(guān)區(qū)域Ⅰ和Ⅱ向其靠攏。開關(guān)區(qū)域Ⅰ和微管結(jié)合區(qū)域Ⅰ(包括Loop 7、b5和Loop 8a) 通過氫鍵相連。因此，受開關(guān)區(qū)域Ⅰ的影響，微管結(jié)合區(qū)域Ⅰ也移向g-phosphate。微管結(jié)合區(qū)域Ⅱ(包括 Loop 11、a4折疊、Loop 12和a5折疊) 在開關(guān)區(qū)域Ⅱ的 C端，但是并沒有隨之移向g-phosphate。這可能有兩種原因：1) Loop 11在無微管結(jié)合時是無序(Disordered) 的狀態(tài)，同開關(guān)區(qū)域Ⅱ沒有氫鍵等相互作用。因此，開關(guān)區(qū)域Ⅱ的變化不能直接反應到微管結(jié)合區(qū)域Ⅱ來。2) AMPPNP是浸泡入晶體活性中心的。微管結(jié)合區(qū)域Ⅱ由于晶格排列 (Crystal packing) 的原因，同晶格中另外一個分子接觸而在一定程度上被“固定”住了。因此，開關(guān)區(qū)域Ⅱ的變化不能導致微管結(jié)合區(qū)域Ⅱ的變化。要觀察到微管結(jié)合區(qū)域Ⅱ可能的變化，驅(qū)動蛋白和AMPPNP的復合物必須是從頭結(jié)晶 (De novo crystallization)，而不能用浸泡的方法。但是這個復合物的結(jié)晶條件還沒有被找到。

驅(qū)動蛋白的ATP水解機制有幾種可能[21-22]。其中一種直接水解的機制是：g-phosphate活化附近的一個水分子，使其分解為一個質(zhì)子和一個帶負電荷的羥基。這個羥基親核攻擊g-phosphate的磷原子，形成一種過渡型的三角雙錐結(jié)構(gòu) (Trigonal bipyramidal structure)。這個過渡結(jié)構(gòu)降低了水解活化能，從而斷裂了g-phosphate和b-phosphate之間的連接，完成水解過程。Parke等在非常規(guī)驅(qū)動蛋白Eg5的研究成果支持這一理論[23]。但是 Sablin和 Kikkawa等在另一種非常規(guī)驅(qū)動蛋白 Kif1A的研究結(jié)果卻不支持這一理論[17,24]。本文對鼠腦驅(qū)動蛋白晶體結(jié)構(gòu)的研究中也沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)證據(jù)。以上研究都采用晶體的 X-光衍射，不能檢測到水解過程中質(zhì)子的存在。晶體的中子衍射可以檢測到氫原子或質(zhì)子的存在，因此對驅(qū)動蛋白水解機理的深入和直接的研究還要用中子衍射的方法。這種方法需要非常大的晶體 (體積大于1 m3)，技術(shù)難度非常大[25-26]。它將成為下階段研究的一個重要內(nèi)容。

根據(jù)以往文獻報道，在Li2SO4結(jié)晶條件下，鼠腦驅(qū)動蛋白同ADP的復合物晶體結(jié)構(gòu)中開關(guān)區(qū)域Ⅱ的谷氨酸237同開關(guān)區(qū)域Ⅰ的精氨酸204有離子鍵 (3.1 ?) 形成[5]。但是在 (NH4)2SO4結(jié)晶條件下，這個離子鍵并不存在。因此，我們推測這個離子鍵對ATP的水解并沒有直接作用。鼠腦驅(qū)動蛋白突變體E237A (表2) 和另外兩種驅(qū)動蛋白Kar3和NCD相應的突變體顯示這個保守的谷氨酸被突變?yōu)楸彼岷?，基礎(chǔ)ATPase酶活沒有變化，但是加入微管不能進一步激活ATPase酶活，而且同微管結(jié)合區(qū)域的親和力大大加強[27-28]。我們注意到不管是在Li2SO4結(jié)晶條件下還是在 (NH4)2SO4結(jié)晶條件下，驅(qū)動蛋白同ADP復合物晶體結(jié)構(gòu)中，谷氨酸237殘基同P-loop中蘇氨酸88形成氫鍵。而在驅(qū)動蛋白同 AMPPNP復合物晶體結(jié)構(gòu)中，g-phosphate將蘇氨酸88推開，谷氨酸237變得無序而不能同蘇氨酸88形成氫鍵。這種變化可能使得谷氨酸 237之后的微管結(jié)合區(qū)更好地同微管結(jié)合。E237A晶體結(jié)構(gòu)表明，當上述氫鍵被破壞后，丙氨酸 237主鏈發(fā)生扭轉(zhuǎn)，從而使得微管結(jié)合區(qū)域也隨之發(fā)生顯著變化。類似的結(jié)構(gòu)變化在 kif1A·AMPPCP復合物的晶體結(jié)構(gòu)中也存在[18]。這些變化可能使得驅(qū)動蛋白同微管的親和力增強。在ATP被水解為ADP和磷酸后，新的ATP分子取代原來的水解產(chǎn)物的整個過程中，ADP的釋放是整個過程的限速步驟，而微管可以大大加速 ADP的釋放，從而提高ATPase的總體酶活[29-30]。微管結(jié)合到驅(qū)動蛋白后，開關(guān)區(qū)域Ⅱ發(fā)生顯著變化，從而導致 P-loop無序而不能緊密結(jié)合ADP[31]。ADP中b-phosphate和P-loop的緊密結(jié)合是ADP結(jié)合力中最重要的部分。當谷氨酸 237被突變?yōu)楸彼岷?，原來谷氨?37殘基同蘇氨酸88之間的氫鍵作用不復存在，這樣開關(guān)區(qū)域Ⅱ的變化不能被傳遞到P-loop，ADP被“鎖住”而不容易釋放，這導致微管不能刺激ADP的釋放?？傊?，開關(guān)區(qū)域Ⅱ的谷氨酸起著聯(lián)系活性中心和微管結(jié)合區(qū)域的作用：ATP中g(shù)-phosphate的存在使得開關(guān)區(qū)域Ⅱ?qū)⑿盘杺鬟f到微管結(jié)合區(qū)域，使得驅(qū)動蛋白同微管的親和力增加。當ATP水解為ADP后，微管的結(jié)合信號通過開關(guān)區(qū)域Ⅱ傳遞回活性中心，刺激ADP的釋放，加速了新的ATP分子的結(jié)合。

致謝：感謝上海同步輻射光源 (SSRF) 光束線BL17U1的工作人員在本課題數(shù)據(jù)搜集和處理時給予的大力支持。

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