基于清晰度的細(xì)胞顯微圖像分割和計(jì)數(shù)方法

王祥生WANG Xiangsheng

王 偉2WANG Wei

基于清晰度的細(xì)胞顯微圖像分割和計(jì)數(shù)方法

王祥生1WANG Xiangsheng

王 偉2WANG Wei

目的針對(duì)細(xì)胞顯微圖像分割和計(jì)數(shù)困難的問題，提出一種基于清晰度的細(xì)胞顯微圖像分割和計(jì)數(shù)方法。資料與方法首先對(duì)細(xì)胞顯微圖像進(jìn)行預(yù)處理，然后對(duì)圖像進(jìn)行離散余弦變換，并截?cái)喔哳l信號(hào)部分，再與原圖做差以區(qū)分清晰部分和模糊部分，結(jié)合細(xì)胞圖像局部聚合度較高的特性，利用區(qū)域生長方法提取完整目標(biāo)，最后進(jìn)行分析和計(jì)數(shù)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針對(duì)細(xì)胞顯微圖像分割和計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確、速度慢的問題，利用該方法分割計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確率＞90%，平均一幅圖片的處理時(shí)間＜100 ms。結(jié)論用清晰度的方法可以快速、準(zhǔn)確地分割細(xì)胞顯微圖像并進(jìn)行分析計(jì)數(shù)，對(duì)快速、準(zhǔn)確地掌握細(xì)胞個(gè)數(shù)及密度有重要意義。

細(xì)胞計(jì)數(shù)；顯微攝影術(shù)；顯微圖像；離散余弦變換

1 方法

DCT是Ahmed等[11]于1974年提出的正交變換方法，DCT變換后信號(hào)有明確的頻率特性，能量更加集中。經(jīng)過DCT變換的圖像高頻部分表示細(xì)節(jié)，低頻部分表示輪廓。通過截?cái)郉CT的高頻信號(hào)部分分析圖像的清晰度[12]，細(xì)胞顯微圖像分割[13]和計(jì)數(shù)方法實(shí)現(xiàn)的思路是：①將圖像灰度化并用中值濾波方法去噪[14]（圖1A）。②將去噪圖像進(jìn)行DCT變換（圖1B）。③將低頻信號(hào)值的一半作為閾值，截?cái)喔哳l信號(hào)，然后進(jìn)行反DCT變換到灰度空間（圖1C）。④將反DCT變換后的圖像與原灰度圖像求差并灰度化（圖1D）。⑤用自適應(yīng)閾值法[15]將步驟④中灰度化后的差值圖像二值化，并用3×3的模板進(jìn)行開閉運(yùn)算去噪，消除離散噪聲點(diǎn)，從而得到圖像的清晰區(qū)域（圖1E）。⑥利用目標(biāo)在局部聚合度比較好的特性，將圖像清晰區(qū)域作為初始生長區(qū)域，進(jìn)行區(qū)域生長，在原始灰度圖像上標(biāo)記鄰域灰度相似的點(diǎn)，如果其鄰域滿足公式（1），則被標(biāo)記為前景點(diǎn)，并從該點(diǎn)繼續(xù)生長；否則，找到下一個(gè)沒有標(biāo)記的生長點(diǎn)進(jìn)行生長，直到全部標(biāo)記完成，得到完整目標(biāo)（圖1F）。

|y1(i, j) – y1(i', j')| ＜ threshold （1）

其中，點(diǎn)（i，j）為當(dāng)前生長點(diǎn)，（i'，j'）為（i，j）的八連通鄰域，threshold為閾值。通常，細(xì)胞內(nèi)部灰度變化較小，與背景之間存在較明顯的邊緣，并且當(dāng)閾值取值過大時(shí)，容易造成過生長現(xiàn)象，因此，threshold一般設(shè)置為較小的值，通過試驗(yàn)，本文threshold設(shè)置為6。⑦提取的細(xì)胞內(nèi)部可能存在很多空洞，同時(shí)還有一些小的孤立的噪聲點(diǎn)，因此利用空洞填充算法[16]去除空洞及噪聲點(diǎn)（圖1G）。⑧進(jìn)行連通區(qū)域標(biāo)記，同時(shí)記錄連通區(qū)域外接矩形坐標(biāo)和連通區(qū)域面積，通過聚類的方法將細(xì)胞按面積聚成3類，其中面積遠(yuǎn)小于另外兩類者被當(dāng)成噪聲去除（圖1H）。

⑨取步驟⑧剩余的兩類中面積較小的一類進(jìn)行排序，將面積中值作為單個(gè)細(xì)胞面積，估計(jì)其他連通區(qū)域包含的細(xì)胞個(gè)數(shù)，最終得到總體的細(xì)胞個(gè)數(shù)。

分別運(yùn)用分水嶺[17,18]分割方法和本文方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中對(duì)分水嶺方法分割后的細(xì)胞進(jìn)行連通區(qū)域提取，通過分割線把粘連的細(xì)胞分開，從而對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。本文算法在計(jì)算機(jī)上采用Visual Studio 2010和OpenCV 2.4.8編程實(shí)現(xiàn)。

圖1 對(duì)本文方法的中間結(jié)果。A為去噪后的灰度圖，B為離散余弦變換，C為DCT反變換后的灰度圖，D為灰度化后的差值圖，E為清晰區(qū)域，F(xiàn)為分割結(jié)果，G為去噪并進(jìn)行空洞填充，H為去除大噪聲

2 結(jié)果

2.1 分割結(jié)果分析 公式（1）中，閾值的選取對(duì)分割結(jié)果的影響較大，閾值選取過小，容易出現(xiàn)漏標(biāo)記前景的情況；反之閾值選取過大，則會(huì)出現(xiàn)過生長，即錯(cuò)標(biāo)記背景為細(xì)胞，見圖2。

用Photoshop軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)圖像進(jìn)行手工分割，得到符合人視覺習(xí)慣的分割作為對(duì)照，使用p=tp/（tp+fn）表示分割的準(zhǔn)確率，其中tp表示正確分割的細(xì)胞像素，fn表示錯(cuò)誤標(biāo)記為背景的細(xì)胞像素，從而得到閾值和準(zhǔn)確率的關(guān)系（圖3）。由圖3可見，區(qū)域生長的閾值＞6之后，準(zhǔn)確率幾乎沒有變化，但是閾值加大會(huì)造成過生長，提高錯(cuò)誤率，因此選取6作為生長閾值。

圖2 過生長（A）和欠生長（B）的分割結(jié)果

圖3 閾值和準(zhǔn)確率的關(guān)系

2.2 計(jì)數(shù)結(jié)果分析 分水嶺分割方法存在過分割和欠分割，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果與實(shí)際計(jì)數(shù)存在一定的誤差，圖4A中紅線表示分割線。本文方法不直接分割粘連細(xì)胞，而是通過分析細(xì)胞連通區(qū)域面積進(jìn)行計(jì)數(shù)，圖4B中不同顏色表明本文方法對(duì)細(xì)胞的不同計(jì)數(shù)。

圖4 分水嶺分割方法（A）與本文方法（B）計(jì)數(shù)結(jié)果比較

另外對(duì)4種不同濃度下的細(xì)胞顯微圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，分別采用分水嶺分割計(jì)數(shù)方法和本文方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)結(jié)果與實(shí)際計(jì)數(shù)結(jié)果比較，誤差見圖5。由圖5可以看出，隨著細(xì)胞濃度的增大，計(jì)數(shù)結(jié)果的誤差增大，主要原因在于隨著細(xì)胞濃度增大，細(xì)胞之間的重疊越發(fā)明顯，給分割造成更多的困難，導(dǎo)致算法誤差加大。而本文方法誤差低于分水嶺分割方法。由于本文方法未直接對(duì)重疊細(xì)胞進(jìn)行分割，因此消除了由于分割方法引入的誤差，受細(xì)胞濃度提高造成的重疊情況影響較小，從而提高了計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率，使計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率＞90%，見表1。

試驗(yàn)平臺(tái)為DELL Precision M6600，處理器為 Intel?Core? i7-2960XM@2.70 GHz（8CPUs），Windows XP操作系統(tǒng)，試驗(yàn)圖像分辨率為500×316像素，因?yàn)槭褂每焖匐x散余弦變換方法，并且不直接分割粘連細(xì)胞圖像，故在一定程度上提高了算法速度，對(duì)一幀圖像進(jìn)行分割、計(jì)數(shù)的平均速度為87.47 ms。對(duì)粘連圖像進(jìn)行分水嶺分割之前，需要進(jìn)行距離變換，將二值圖像轉(zhuǎn)換為距離灰度圖像，并且當(dāng)圖像中細(xì)胞越多，分割算法的效率越慢，對(duì)一幀圖像進(jìn)行分割的平均速度為114.38 ms，見表1。

圖5 分水嶺分割計(jì)數(shù)方法和本文方法計(jì)數(shù)結(jié)果誤差曲線比較

表1 分水嶺分割計(jì)數(shù)方法和本文方法計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確率比較

3 討論

由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的復(fù)雜性，目前細(xì)胞圖像的分割方法受細(xì)胞粘連影響較大，無法快速、準(zhǔn)確地分割細(xì)胞并計(jì)數(shù)。通過分水嶺的方法可以分割粘連細(xì)胞，但受噪聲影響較大，容易產(chǎn)生過分割和欠分割現(xiàn)象，尚無法完善解決。本文在全局范圍內(nèi)用清晰度區(qū)分細(xì)胞和背景，在局部用灰度信息進(jìn)行區(qū)域生長提取完整細(xì)胞區(qū)域，既利用了圖像局部顏色一致性的特征，又基于拍照時(shí)將焦點(diǎn)聚焦在細(xì)胞區(qū)域的前提，在全局通過清晰度區(qū)分細(xì)胞和背景，在一定程度上減少了誤分割，結(jié)合細(xì)胞在局部聚合度較好的特性，利用局部灰度特征進(jìn)行區(qū)域生長，從而達(dá)到細(xì)胞顯微圖像分割的目的，提高了分割準(zhǔn)確率。在計(jì)數(shù)過程中，通過分析各個(gè)連通區(qū)域的面積，避免了粘連細(xì)胞直接分割帶來的誤差，并提高了算法的速度。

快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行分割并得到細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法在臨床細(xì)胞計(jì)數(shù)、密度分析等方面發(fā)揮越來越重要的作用，對(duì)實(shí)際的診斷工作具有重要的輔助意義。

傳統(tǒng)的分水嶺分割方法對(duì)重疊細(xì)胞進(jìn)行分割時(shí)，存在過分割和欠分割現(xiàn)象，計(jì)數(shù)誤差較大，且隨著細(xì)胞濃度增加，誤差明顯增大。本文應(yīng)用細(xì)胞面積聚類方法對(duì)細(xì)胞重疊情況進(jìn)行分類判斷，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)，準(zhǔn)確率＞90%。該計(jì)數(shù)方法不直接分割重疊細(xì)胞，而是基于細(xì)胞面積的統(tǒng)計(jì)信息對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行分析和判定，消除了對(duì)重疊細(xì)胞進(jìn)行分割產(chǎn)生的誤差，提高技術(shù)準(zhǔn)確度，同時(shí)受細(xì)胞濃度的影響較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同濃度細(xì)胞情況下，該算法技術(shù)準(zhǔn)確率都高于分水嶺分割方法。

本文利用清晰度進(jìn)行細(xì)胞顯微圖像分割和計(jì)數(shù)的方法具有較廣闊的應(yīng)用范圍，其優(yōu)點(diǎn)在于：采用清晰度在全局范圍內(nèi)獲取細(xì)胞圖像的清晰部分，再結(jié)合細(xì)胞顯微圖像局部聚合度較高的特性，進(jìn)行區(qū)域生長，從而得到完整的細(xì)胞圖像。

[1] 金征宇. 醫(yī)學(xué)影像學(xué). 第2版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2010.

[2] van Ginneken B, Frangi AF, Staal JJ, et al. Active shape model segmentation with optimal features. IEEE Trans Med Imaging, 2002, 21(8): 924-933.

[3] Van Ginneken B, Romeny BM, Viergever MA. Computer-aided diagnosis in chest radiography: a survey. IEEE Trans Med Imaging, 2001, 20(12): 1228-1241.

[4] 蘇茂君, 王兆濱, 張紅娟, 等. 基于PCNN自動(dòng)波特征的血細(xì)胞圖像分割和計(jì)數(shù)方法. 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào), 2009, 28(1): 145-148, 152.

[5] 武宗茜, 王鵬, 丁天懷. 活動(dòng)輪廓模型在重疊藻細(xì)胞計(jì)數(shù)中的應(yīng)用. 計(jì)算機(jī)工程, 2012, 38(3): 209-211.

[6] 任亞恒, 溫佩芝, 黃文明, 等. 一種改進(jìn)的大鼠精子圖像分割及計(jì)數(shù)算法. 計(jì)算機(jī)工程, 2011, 37(7): 243-245, 248.

[7] 哈斯蘇榮, 阿木古楞, 七十三. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的自動(dòng)分割與分類計(jì)數(shù). 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào), 2010, 29(2): 166-171.

[8] Malik AS, Humayun J. Parallelization of discrete cosine transform in shape from focus. Adv Sci Letters, 2013, 19(5): 1459-1462.

[9] Dabbaghchian S, Ghaemmaghami MP, Aghagolzadeh A. Feature extraction using discrete cosine transform and discrimination power analysis with a face recognition technology. Pattern Recognit, 2010, 43(4): 1431-1440.

[10] Liu ZJ, Xu L, Liu T, et al. Color image encryption by using Arnold transform and color-blend operation in discrete cosine transform domains. Opt Commun, 2011, 284(1): 123-128.

[11] Ahmed N, Natarajan T, Rao KR. Discrete cosine transform. IEEE Trans on Computers, 1974, 100(1): 90-93.

[12] 左倩, 孫浩然, 于曉坤, 等. 自適應(yīng)統(tǒng)計(jì)迭代和基于模型的迭代重建算法對(duì)CT結(jié)腸成像圖像質(zhì)量和診斷的影響. 中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志, 2014, 22(5): 331-335.

[13] 王婷, 后桂榮, 張寧, 等. 基于激光共聚焦顯微鏡圖像的黑色素瘤計(jì)算機(jī)輔助診斷算法研究. 中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志, 2013, 21(2): 130-133.

[14] 周世勛, 張杰. 灰度預(yù)分割對(duì)三維醫(yī)學(xué)圖像配準(zhǔn)的作用. 中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志, 2013, 21(4): 301-304.

[15] 王方石, 須德, 吳偉鑫. 基于自適應(yīng)閾值的自動(dòng)提取關(guān)鍵幀的聚類算法. 計(jì)算機(jī)研究與發(fā)展, 2005, 42(10): 1752-1757.

[16] 樊亞春, 周明全, 耿國華. 消除光照影響的背景減除算法. 中國圖象圖形學(xué)報(bào)A, 2009, 14(7): 1413-1417.

[17] 王開義, 張水發(fā), 楊鋒, 等. 基于分水嶺和改進(jìn)MRF的馬鈴薯丁粘連圖像在線分割. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2013, 44(9): 187-192.

[18] 苗玉彬, 王浙明, 劉秦. 水果輪廓特征提取的Zernike矩分水嶺分割方法. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2013, 29(1): 158-163.

（本文編輯 張春輝）

Defnition Based Cell Microscopic Image Segmentation and Counting Algorithm

PurposeTo propose a definition based algorithm for segmenting and counting cell microscopic images.Materials and MethodsCell microscopic images were first pretreated and then transformed using discrete cosine transformation (DCT). The high frequency part was truncated and re-converted to differentiate clear and blurred images. The clear foreground regions were obtained. The intact objective was extracted using region growing method. Statistics and analysis of cell number were then conducted.ResultsThis algorithm showed good performance in cell microscopic image counting with accuracy of over 90% at less than 100 ms/image.ConclusionDefinition based method is fast and accurate in cell microscopic image segmentation and counting.

Cell count; Photomicrography; Microscopic images; Discrete cosine transform

10.3969/j.issn.1005-5185.2014.10.020變換（discrete cosine transform, DCT）[8-10]后低頻信號(hào)部分表示圖像輪廓，高頻部分表示細(xì)節(jié)的特性，截?cái)郉CT高頻信號(hào)，即去除圖像的細(xì)節(jié)信息，然后與原圖做差分，得到圖像的細(xì)節(jié)信息，結(jié)合細(xì)胞圖像局部聚合度較高的特征，利用區(qū)域生長方法提取完整的目標(biāo)，最后進(jìn)行分析和計(jì)數(shù)，從而達(dá)到對(duì)細(xì)胞顯微圖像的準(zhǔn)確分割和計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該算法非常有效。

1. 山東省章丘市中醫(yī)醫(yī)院放射科 山東章丘250200

2. 黃淮學(xué)院信息工程學(xué)院 河南駐馬店463000

王 偉

College of Information Engineering, Huanghuai University, Zhumadian 463000, China

Address Correspondence to: WANG Wei

E-mail: 45703557@qq.com

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（61300065）。

Q-334

2014-06-01

修回日期：2014-09-17

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2014年 第22卷 第10期：797-800

Chinese Journal of Medical Imaging

2014 Volume 22(10): 797-800

細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)非常重要的工作[1]，而細(xì)胞顯微圖像的量化分析是這一研究的前提之一。與人工方法相比，顯微圖像處理方法在對(duì)生物圖像分割及計(jì)數(shù)上更加省時(shí)、省力，并且容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。然而由于細(xì)胞顯微圖像的低灰度、亮度不均勻以及細(xì)胞顯微圖像特有的復(fù)雜結(jié)構(gòu)特性，使細(xì)胞顯微圖像分割和計(jì)數(shù)非常困難[2,3]。

蘇茂君等[4]提出了基于脈沖耦合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（PCNN）自動(dòng)波特征的血細(xì)胞圖像分割和計(jì)數(shù)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)血細(xì)胞圖像的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)和特定細(xì)胞的單獨(dú)分割，但對(duì)于2個(gè)相鄰重疊的血細(xì)胞計(jì)數(shù)不太準(zhǔn)確，而且不適用于相鄰聯(lián)系緊密、形狀特殊的植物細(xì)胞圖像。武宗茜等[5]提出基于活動(dòng)輪廓模型的重疊藻細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)方法，不直接分割重疊細(xì)胞，消除了重疊細(xì)胞直接分割帶來的誤差，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率高于90%。任亞恒等[6]提出一種基于改進(jìn)的Ostu法對(duì)大鼠精子圖像進(jìn)行分割，可以實(shí)現(xiàn)精子圖像的快速準(zhǔn)確分割，并自動(dòng)統(tǒng)計(jì)精子個(gè)數(shù)，但受精子粘連的影響較大。

由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的復(fù)雜性[7]，不同的方法適用于特定細(xì)胞圖像的分割。采集細(xì)胞顯微圖像時(shí)，通常將焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞，而背景處于離焦?fàn)顟B(tài)。本研究通過對(duì)顯微圖像的清晰度進(jìn)行研究，提出一種基于清晰度的細(xì)胞顯微圖像分割和計(jì)數(shù)方法，其中清晰度指影像上各細(xì)部影紋及其邊界的清晰程度。該方法利用圖像經(jīng)過離散余弦