HPLC 法測(cè)定復(fù)方吡拉西坦腦蛋白水解物片中硫酸軟骨素鈉的含量

劉志輝（梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣東梅州 514071）

復(fù)方吡拉西坦腦蛋白水解物片為復(fù)方制劑，主要成分為吡拉西坦、腦蛋白水解物、谷氨酸、硫酸軟骨素鈉、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素E；適用于急慢性腦血管病、腦外傷、各種中毒性腦病等原因引起的腦神經(jīng)功能障礙及記憶力減退、先天性腦發(fā)育不全、兒童智能發(fā)育遲緩、老年性癡呆等的治療[1]。其中硫酸軟骨素鈉主要為N-乙酰半乳糖胺（2-乙酰胺-2-脫氧-β-D-吡喃半乳糖）和D-葡萄糖醛酸的共聚物的硫酸酯鈉鹽，共聚物內(nèi)己糖通過β-1，3及β-1，4糖苷鍵交替連接。復(fù)方吡拉西坦腦蛋白水解物片中硫酸軟骨素鈉測(cè)定方法現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是分光光度法[2]：利用鹽酸水解供試品生成氨基己糖，然后在堿性條件下與乙酰丙酮反應(yīng)，生成色原物質(zhì)，再與對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液反應(yīng)產(chǎn)生紅色，以氨基葡萄糖為對(duì)照品，用分光光度法在525 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，乘以系數(shù)0.830 9 計(jì)算氨基葡萄糖的量。該法水解產(chǎn)生的氨基己糖系一種氨基半乳糖，半乳糖是一種由6個(gè)碳和1個(gè)醛組成的單糖，歸類為醛糖和己糖；葡萄糖是己醛糖，氨基半乳糖與氨基葡萄糖的分子式相同，但結(jié)構(gòu)式是完全不同的，因此該分光光度法不僅不能準(zhǔn)確測(cè)定硫酸軟骨素鈉的主體結(jié)構(gòu)的真實(shí)含量，而且結(jié)果重現(xiàn)性不好[3]。筆者參考文獻(xiàn)[4-8]，建立了采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定復(fù)方吡拉西坦腦蛋白水解物片中硫酸軟骨素鈉含量的方法，結(jié)果表明該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，可為控制該藥品的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀、紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

硫酸軟骨素鈉對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140792-201001，純度：100%）；樣品為復(fù)方吡拉西坦腦蛋白水解物片（復(fù)方制劑，白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠二分廠，批號(hào)：20130620、20121013、20131102，規(guī)格：每片含硫酸軟骨素鈉20 mg）；磷酸二氫銨為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：JADE-PAK ODS-AQ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.008 mol/L磷酸二氫銨溶液（pH＝3.6），流速：0.5 ml/min；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：194 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液。精密稱取在105 ℃干燥4 h的硫酸軟骨素鈉對(duì)照品約25 mg，置于25 ml 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，置于200 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液。取樣品20 片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于硫酸軟骨素鈉25 mg），置于50 ml量瓶中，加乙腈5 ml，加水25 ml，超聲（功率：250 W，頻率：45 kHz）約10 min使硫酸軟骨素鈉溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液10 ml，置于200 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液。按樣品處方比例，制備除硫酸軟骨素鈉外的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取供試品（批號(hào)：20130620）溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，以硫酸軟骨素鈉峰計(jì)理論板數(shù)為11 369，硫酸軟骨素鈉峰與相鄰峰的分離度為2.01，見圖1。

2.4 專屬性試驗(yàn)

分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性樣品溶液，注入色譜儀。結(jié)果，陰性樣品溶液在與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處，無色譜峰出現(xiàn)，表明處方中各成分及輔料不干擾硫酸軟骨素鈉的含量測(cè)定，見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.對(duì)照品溶液；C.陰性樣品溶液；1.硫酸軟骨素Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability testA.sample solution；B.reference solution；C.negative solution；1.chondroitin sulfate

2.5 破壞性試驗(yàn)

分別取樣品細(xì)粉（批號(hào)：20130620）適量（約相當(dāng)于硫酸軟骨素鈉25 mg），置于50 ml量瓶中，其中3份分別加入0.1 mol/L鹽酸溶液5 ml、0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液5 ml 和30%雙氧水2 ml，放置30 min后中和，加乙腈5 ml、水25 ml，超聲（功率：250 W，頻率：45 kHz）約10 min，加水稀釋至刻度，搖勻；另外2 份分別置于3 000 lx光線下放置6 h和100 ℃加熱12 h后，加乙腈5 ml、水25 ml，超聲約10 min，加水稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液注入色譜儀。結(jié)果顯示，硫酸軟骨素鈉對(duì)酸、堿和光照均較穩(wěn)定，雜質(zhì)未見明顯變化，加熱條件下發(fā)生降解，但在氧化條件下更易降解；各破壞條件下的降解產(chǎn)物峰對(duì)硫酸軟骨素鈉峰均無干擾，分離效果良好，見圖2。

2.6 定量限和檢測(cè)限試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，以不同比例稀釋，在上述色譜條件下測(cè)定。以信噪比為10∶1確定定量限為0.75 μg/ml，即7.5 ng；以信噪比為3∶1確定檢測(cè)限為0.25 μg/ml，即2.5 ng。

2.7 線性關(guān)系考察

精密稱取硫酸軟骨素鈉對(duì)照品約62.5 mg，置于50 ml 量瓶中，加水振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品貯備液1、1.5、1、2、3、1、5 ml，置于250、250、100、100、100、25、100 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，制備成5、7.5、12.5、25、37.5、50、62.5 μg/ml 的硫酸軟骨素鈉對(duì)照品系列溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程A＝19 166.284 6c+4.589 3（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，硫酸軟骨素鈉檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為5～62.5 μg/ml。

2.8 精密度試驗(yàn)

取“2.12”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，其峰面積RSD為0.1%（n＝6）。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理制備、進(jìn)樣，平行測(cè)定6 次，平均含量為19.66 mg，RSD 為0.3%（n＝6）。

2.10 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：20130620，每片含19.52 mg），加入硫酸軟骨素鈉對(duì)照品分別制備成相當(dāng)于標(biāo)示量80%、100%、120%含量的樣品，各3個(gè)共9份樣品，按含量測(cè)定方法測(cè)定含量，結(jié)果平均回收率為99.1%，RSD＝0.7%。結(jié)果見表1。

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.酸破壞后樣品；B.堿破壞后樣品；C.光照破壞后樣品；D.熱破壞后樣品；E.氧化破壞后樣品；1.硫酸軟骨素Fig 2 HPLC chromatograms of destruction testA.sample destructed by acid；B.sample destructed by alkali；C.sample destructed by light；D.sample destructed by high temperature；E.sample destructed by oxidation；1.chondroitin sulfate

表1 回收率試驗(yàn)（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（n＝3）

2.11 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品（批號(hào)：20130620）溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后測(cè)定，結(jié)果硫酸軟骨素鈉的峰面積的RSD＝0.6%（n＝6）。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.12 樣品含量測(cè)定

按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，分別對(duì)3批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Results of content determination of samples

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品溶液，于190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描繪制其紫外吸收光譜，結(jié)果，硫酸軟骨素鈉在194 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，故本次試驗(yàn)選其為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的選擇

3.2.1 流動(dòng)相的選擇。分別試用辛烷對(duì)氨基苯磺酸鈉溶液、庚烷磺酸鈉溶液[4-5]和磷酸二氫銨溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰形均好，出峰時(shí)間分別為5.957、4.854、7.546 min，與相鄰峰的分離度分別為1.36、1.24、2.01，但前2 種溶液為流動(dòng)相時(shí)出峰太快，且分離效果不太好，因此最終采用磷酸二氫銨溶液。因一般情況下加入乙腈能增加洗脫能力，使峰形更好，故筆者嘗試加入一定比例的乙腈[4-5]：0.008 mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈（97 ∶3）、0.008 mol/L 磷酸二氫銨溶液-乙腈（95 ∶5）、0.008 mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈（90 ∶10），結(jié)果并未見柱效提高和分離效果更好，同時(shí)出峰時(shí)間卻加快了不少，故未加入乙腈。也嘗試過選用不同離子強(qiáng)度的磷酸二氫銨溶液（0.008、0.010、0.015 mol/L），結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同離子強(qiáng)度下柱效和分離效果未見明顯變化，因此選用0.008 mol/L 的離子強(qiáng)度。色譜柱選用了水性柱，其不但能夠支持100%的無機(jī)相，且不會(huì)損害色譜柱。

3.2.2 溶劑的選擇。樣品為復(fù)方制劑，其中吡拉西坦、維生素B1、維生素B6、硫酸軟骨素鈉溶于水，谷氨酸微溶于水，腦蛋白水解物為蛋白質(zhì)類。當(dāng)以水作溶劑時(shí)，在硫酸軟骨素峰附近出現(xiàn)有較大的峰，與硫酸軟骨素峰層疊在一起分不開；當(dāng)加入5 ml 乙腈作為提取溶劑時(shí)，因減少了其他水溶性物質(zhì)的溶解度，結(jié)果表明能較好地分開硫酸軟骨素峰與相鄰峰。因此采用25 ml水中加入5 ml乙腈為提取溶劑。

復(fù)方吡拉西坦腦蛋白水解物片是復(fù)方制劑，成分比較多，若參照文獻(xiàn)進(jìn)行酶解[3]，硫酸軟骨素可酶解成硫酸軟骨素A、B、C，而硫酸軟骨素A、B、C 與相鄰峰難以分開。本試驗(yàn)則不進(jìn)行酶解試驗(yàn)，故直接測(cè)定的成分是硫酸軟骨素鈉，操作較為簡(jiǎn)單，故可作為測(cè)定硫酸軟骨素鈉含量的方法依據(jù)。

[1]白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠二分廠.復(fù)方吡拉西坦腦蛋白水解物片說明書[S].2010.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)：化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：第十六冊(cè)[S].2003：317-318.

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