促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖方法的研究進(jìn)展

于海生，王 寧（1.重鋼總醫(yī)院超聲科，重慶 400084；2.重慶市腫瘤醫(yī)院超聲科，重慶 400030）

間充質(zhì)干細(xì)胞屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，因此統(tǒng)稱骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）。BMSCs具有來源方便且易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化等特點(diǎn)，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，在一定的誘導(dǎo)條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，且免疫原性弱。因此，BMSCs作為組織工程學(xué)中的理想種子細(xì)胞受到了越來越多學(xué)者的重視[1-4]。

研究表明，生產(chǎn)組織工程化產(chǎn)品要獲得臨床的廣泛應(yīng)用，需要大量的種子細(xì)胞[5]。盡管骨髓中BMSCs 的含量相對較多，但在正常狀態(tài)下生長緩慢，而且隨著年齡增加BMSCs的數(shù)量將逐漸減少。因此，要想獲得數(shù)量多、活性高、分化功能良好的種子細(xì)胞以滿足組織工程學(xué)應(yīng)用要求，就必須對BMSCs進(jìn)行擴(kuò)增。因此，如何通過有效的技術(shù)手段來獲得大規(guī)模、具有再生活力的種子細(xì)胞，成為了當(dāng)前組織工程研究亟需解決的關(guān)鍵問題。本文以“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞”“種子細(xì)胞”“組織工藝學(xué)”“細(xì)胞增殖”等的中、英文詞匯為關(guān)鍵詞，組合檢索2000－2013年中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、PubMed等中的文獻(xiàn)，結(jié)果共查詢到文獻(xiàn)106篇，其中有效文獻(xiàn)27篇，現(xiàn)對有關(guān)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的方法進(jìn)行綜述。

1 中藥對BMSCs增殖的影響

目前，中藥促進(jìn)BMSCs的增殖研究取得了很大進(jìn)展。中藥具有滋陰補(bǔ)陽、強(qiáng)身壯體、增智健腦、抗衰老和調(diào)節(jié)免疫功能、毒副作用小、療效好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)BMSCs增殖研究中，并已形成產(chǎn)品應(yīng)用于臨床中以促進(jìn)BMSCs增殖，如將中藥用于治療骨質(zhì)疏松和骨折修復(fù)等。中藥主要通過調(diào)動或調(diào)整機(jī)體細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制以促進(jìn)BMSCs 增殖。Chen DF 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，龜板提取物能夠促進(jìn)BMSCs增殖，細(xì)胞增殖活性明顯活躍。同時(shí)，篩選龜板提取物有效濃度范圍為0.01～3.0 mg/ml，經(jīng)細(xì)胞周期分析表明，龜板提取物能增加處于S期（增殖期）BMSCs 的比例，并證明了龜板提取物的主要化學(xué)成分（主要含有脂肪酸、類固醇及氨基酸等）和藥理活性的機(jī)制。劉國巖等[7]利用不同質(zhì)量濃度骨碎補(bǔ)（0.2、2、20 mg/ml）促進(jìn)BMSCs 增殖，研究表明增殖活性因子之一堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表達(dá)增加，成骨能力明顯增強(qiáng)，從而加速了BMSCs 增殖，其中以質(zhì)量濃度2 mg/ml 促進(jìn)作用最為明顯。黃進(jìn)等[8]利用黃芪多糖體外促進(jìn)BMSCs增殖，1、2、3 mg/ml黃芪多糖組均具有促進(jìn)BMSCs增殖，MTT檢測細(xì)胞吸光值（0.499 8±0.005）、（0.496 3±0.005）、（0.472 5±0.005）明顯高于空白對照組（0.360 8±0.005），其中以1 mg/ml 促進(jìn)作用最為明顯（P＜0.01）。

雖然中藥促進(jìn)BMSCs的增殖取得了很大進(jìn)展，但是中藥促進(jìn)BMSCs增殖尚存在以下問題：中藥強(qiáng)調(diào)的是多靶點(diǎn)體系與分子之間的協(xié)同作用，而且中藥組織成分復(fù)雜，多為復(fù)方用藥，其有效化學(xué)成分難以明確，不能高效利用；再者，中藥與BMSCs 的量效關(guān)系、藥理作用及其作用機(jī)制尚不十分清楚。因此，今后應(yīng)加強(qiáng)對此類中藥進(jìn)行有效分子水平活性成分提取，以確定中藥的有效成分，并對其作用機(jī)制進(jìn)行深人研究，從細(xì)胞水平、分子水平或基因水平方面揭示中藥促進(jìn)BMSCs增殖的機(jī)制具有重要意義。

2 電磁場對BMSCs增殖的影響

研究表明，脈沖電磁場（Pulsed electromagnetic fields，PEMFs）可促進(jìn)骨組織的愈合和重建，具有促進(jìn)種子細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化、刺激骨局部生長因子分泌、合成細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）和加速骨的發(fā)育等多種作用。目前，臨床上利用電磁場設(shè)備進(jìn)行骨折延遲愈合、骨不連結(jié)、骨質(zhì)疏松等治療，具有效果顯著、操作簡便、費(fèi)用低廉等特點(diǎn)[9-11]。

電磁場頻率在1～100 Hz 范圍時(shí)會對組織和細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，而人體骨骼系統(tǒng)的內(nèi)生性活動頻率范圍在步態(tài)頻率（1～5 Hz）到肌肉收縮的動力頻率（10～100 Hz）間變化。Lee JH等[12]認(rèn)為，最有效的電磁場頻率范圍應(yīng)該與機(jī)體正常功能活動頻率相接近，才能使電磁場發(fā)揮最大的刺激功效作用。Liu C等[13]利用電磁場強(qiáng)度1 mT，頻率為10、30、50、70 Hz刺激體外培養(yǎng)的第3代BMSCs，刺激時(shí)間2 h，發(fā)現(xiàn)電磁場頻率10 Hz 時(shí)能夠大幅提升BMSCs 增殖標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素的表達(dá)，BMSCs增殖活性明顯增強(qiáng)。然而，電磁場頻率在50、70 Hz時(shí)，BMSCs細(xì)胞增殖活性反而下降。

目前，PEMFs 作用于BMSCs 的增殖機(jī)制還不夠明確，雖然已形成產(chǎn)品并應(yīng)用于臨床，但是僅在小范圍內(nèi)應(yīng)用，如何獲得更大規(guī)模、安全高效的應(yīng)用，還有待進(jìn)一步研究。

3 ECM對BMSCs增殖的影響

ECM由大分子構(gòu)成，其構(gòu)成錯(cuò)綜復(fù)雜，能為細(xì)胞的生長及活動提供適宜的場所。研究表明，ECM 可通過自身所帶電荷先吸附到培養(yǎng)儀器表面，然后BMSCs 再與ECM 結(jié)合，從而加速BMSCs黏附和貼壁，細(xì)胞與基質(zhì)這種黏附對于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖行為十分重要[14]。

Jager M 等[15]將BMSCs 分別接種到D，D，L，L-聚交酯（PLLA）、Ⅰ/Ⅲ型膠原以及聚乳素-910/聚二氧環(huán)己酮（PGPD）3種支架上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 h 后鏡下觀察Ⅰ/Ⅲ型膠原上BMSCs的貼壁數(shù)量明顯多于其他兩個(gè)支架細(xì)胞（膠原＞PLLA＞PCPD）。ECM促進(jìn)BMSCs增殖的機(jī)制目前還不完全清楚，但Larsen M[16]等推測其促進(jìn)增殖的機(jī)制可能與化學(xué)信號通過整合素-黏著斑（Focal adhesion plaques，F(xiàn)AP）激酶-胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）途徑傳遞有關(guān)。整合素的胞外區(qū)與ECM相連，胞內(nèi)區(qū)與細(xì)胞骨架相接，形成FAP，由此將ECM 產(chǎn)生的化學(xué)信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)BMSCs 的生長、增殖、遷移等過程。但是，ECM 這種促進(jìn)BMSCs增殖的機(jī)制還有待證實(shí)，相應(yīng)的技術(shù)路線仍需進(jìn)一步完善。

4 機(jī)械刺激對BMSCs增殖的影響

機(jī)械刺激對BMSCs的體外增殖也有重要的調(diào)節(jié)作用。機(jī)體細(xì)胞和組織器官處于一種復(fù)雜的力學(xué)微環(huán)境中，BMSCs 的增殖和分化高度依賴其所處的微環(huán)境[17-18]。Song G 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，不同機(jī)械刺激的大小、作用方式及作用時(shí)間對BMSCs增殖分化的調(diào)節(jié)作用不盡相同。當(dāng)機(jī)械刺激頻率為1 Hz、形變量為5%并分別拉伸15、30、60 min 時(shí)，機(jī)械刺激能顯著促進(jìn)BMSCs增殖；當(dāng)形變量增加至10%、拉伸60 min時(shí)，細(xì)胞增殖會受到抑制；繼續(xù)增加形變量至15%、拉伸15 min時(shí)則會抑制BMSCs 增殖；將拉伸時(shí)間延長至30、60 min 時(shí)卻會再次促進(jìn)BMSCs 增殖；然而長時(shí)間的機(jī)械拉伸（12 h 或24 h）對BMSCs增殖將起到抑制作用。經(jīng)李曉娜等[20]證實(shí)，機(jī)械拉伸刺激能影響大鼠BMSCs的遷移行為，基質(zhì)金屬蛋白酶2（Metalloproteinases，MMP-2）、MMP-9在此過程中可能起著重要的介導(dǎo)作用，但具體機(jī)制目前還不夠明確。

適當(dāng)?shù)臋C(jī)械力學(xué)刺激可促進(jìn)體外細(xì)胞的增殖和功能的維持，但過度或持續(xù)時(shí)間過長的機(jī)械刺激又會對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成損害[21]。目前，這種機(jī)械力作用的大小及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

5 生長因子對BMSCs增殖的影響

細(xì)胞因子是組織工程中的重要因素，其通過細(xì)胞間的信號傳遞來影響細(xì)胞活動，具有促進(jìn)或抑制細(xì)胞分裂、增殖、遷移和基因表達(dá)等作用。生長因子的合理應(yīng)用對組織工程起著關(guān)鍵作用，目前在骨組織中發(fā)現(xiàn)了十幾種生長因子。其中，bFGF、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、胰島素樣生長因子（IGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）和表皮生長因子（EGF）等多種細(xì)胞因子對BMSCs具有重要的調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和膠原合成、加速血管生長及在骨吸收改建方面發(fā)揮作用。因此，在組織工程對細(xì)胞因子合理使用或調(diào)控BMSCs的適時(shí)適量表達(dá)十分重要。研究表明，bFGF 是目前已知最強(qiáng)的促細(xì)胞生長因子[22]。Yuan S等[23]研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4/7（Bone morphogenetic protein，BMP-4/7）能顯著促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖（P＜0.05）；同時(shí)，也能促進(jìn)BMSCs 的成骨分化。BMP-4/7 和bFGF在促進(jìn)細(xì)胞增殖時(shí)具有顯著的協(xié)同作用。

隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)不斷深入研究，各種生長因子在組織工程中的作用日益受到重視。但其使用過程中還存在諸多問題：（1）生長因子與細(xì)胞增殖之間的量效關(guān)系、相互作用、協(xié)同或拮抗作用及其作用機(jī)制都不十分明確，因此細(xì)胞增殖是一個(gè)極其復(fù)雜的過程。經(jīng)李斌等[24]證實(shí)，TGF-β1 分別與bFGF、IGF-I 在誘導(dǎo)BMSCs 形成軟骨細(xì)胞的過程中具有協(xié)同作用。但各種生長因子之間的相互作用機(jī)制及量效關(guān)系目前尚不明確，需要長期的探究。（2）生長因子的生物活性難以控制，極易使種子細(xì)胞發(fā)生定向分化而變性，造成細(xì)胞基因突變，從而導(dǎo)致危險(xiǎn)。（3）生產(chǎn)生長因子的費(fèi)用較高。

6 轉(zhuǎn)基因技術(shù)對BMSCs增殖的影響

轉(zhuǎn)基因（Gene transfer）是指將外源目的基因通過載體轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞內(nèi)，以補(bǔ)償靶細(xì)胞的基因缺陷。其主要作用是調(diào)節(jié)靶細(xì)胞蛋白質(zhì)分泌水平，使靶細(xì)胞獲得新的生物學(xué)行為和功能。利用轉(zhuǎn)基因方法促進(jìn)種子細(xì)胞增殖是當(dāng)今組織工程研究中的又一熱點(diǎn)。蔣柳宏等[25]利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將真核重組表達(dá)質(zhì)粒（bFGF-pcDNA3）轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的BMSCs，篩選出穩(wěn)定表達(dá)bFGF的BMSCs細(xì)胞株，并發(fā)現(xiàn)自身表達(dá)的bFGF可促進(jìn)BMSCs 增殖。Lin WP 等[26]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將生長因子Neuroglobin 植入實(shí)驗(yàn)兔的BMSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兔的損傷組織重塑和纖維束生長顯著增快。目前，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已將人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因成功轉(zhuǎn)入中國貴州小豬的BMSCs內(nèi)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的BMSCs與正常培養(yǎng)的BMSCs具有相同的增殖活性，同時(shí)轉(zhuǎn)染后的BMSCs壽命得到延長[27]。但是，這項(xiàng)技術(shù)也面臨一些難題需要解決，如基因轉(zhuǎn)染效率低、體內(nèi)表達(dá)時(shí)間短、是否會導(dǎo)致惡變及轉(zhuǎn)基因后能否保持原來的生物學(xué)特性等。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)還處于初步研究階段，技術(shù)條件的不完善決定了其在短時(shí)間內(nèi)難以全面推廣應(yīng)用。

7 結(jié)語

BMSCs 作為組織工程學(xué)中的理想種子細(xì)胞，近年來受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域乃至整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，如中藥、電磁場擴(kuò)增種子細(xì)胞都已形成產(chǎn)品應(yīng)用于臨床。對種子細(xì)胞的大量擴(kuò)增是其要解決的關(guān)鍵問題。上述幾種促進(jìn)BMSCs增殖的方法，雖然在種子細(xì)胞的擴(kuò)增方面起到了一定作用，但是每種方法都存在或多或少的缺陷，需要更加深入地進(jìn)行探究。當(dāng)前，利用上述方法對種子細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增仍存在一定的局限性，還無法在短期內(nèi)推廣應(yīng)用。展望未來，尋找一種更為簡便、經(jīng)濟(jì)、安全、有效的擴(kuò)增種子細(xì)胞的方法顯得尤為重要。

[1]Mohammadian M，Shamsasenjan K，Lotfi NP，et al.Mesenchymal stem cells：new aspect in cell-based regenerative therapy[J].Adv Pharm Bull，2013，3（2）：433.

[2]Yue Y，Yang X，Wei X，et al.Osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells prompted by low-intensity pulsed ultrasound[J].Cell Prolif，2013，46（3）：320.

[3]Kim SM，Jung JU，Ryu JS，et al.Effects of gangliosides on the differentiation of human mesenchymal stem cells into osteoblasts by modulating epidermal growth factor receptors[J].Biochem Biophys Res Commun，2008，371（4）：866.

[4]Pelttari K，Steck E，Richter W.The use of mesenchymal stem cells for chondrogenesis[J].Injury，2008，39（1）：58.

[5]Mahmoudifar N，Doran PM.Chondrogenesis and cartilage tissue engineering：the longer road to technology development[J].Trends Biotechnol，2012，30（3）：166.

[6]Chen DF，Zeng HP，Du SH，et al.Extracts from plastrum testudinis promote proliferation of rat bone-marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Cell Prolif，2007，40（2）：196.

[7]劉國巖，徐展望，徐琬梨.骨碎補(bǔ)提取物對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及Cbfα-1 表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥，2013，53（25）：10.

[8]黃進(jìn)，張進(jìn)，徐志偉.黃芪多糖對體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和干細(xì)胞因子表達(dá)的刺激作用[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，38（4）：343.

[9]馮玉，白文芳，許偉成，等.低頻電磁場促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國組織工程研究，2013，17（32）：5 819.

[10]Esposito M，Lucariello A，Riccio I，et al.Differentiation of human osteoprogenitor cells increases after treatment with pulsed electromagnetic fields[J].In Vivo，2012，26（2）：299.

[11]Jansen JHW，van der Jagt OP，Punt BJ，et al.Stimulation of osteogenic differentiation in human osteoprogenitor cells by pulsed electromagnetic fields：an in vitro study[J].BMC Musculoskeletal Disorders，2010，11（1）：188.

[12]Lee JH，McLeod KJ.Morphologic responses of osteoblastlike cells in monolayer culture to ELF electromagnetic fields[J].Bioelectromagnetics，2000，21（2）：129.

[13]Liu C，Yu J，Yang Y，et al.Effect of 1 mT sinusoidal electromagnetic fields on proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stromal cells[J].Bioelectromagnetics，2013，34（6）：453.

[14]Wei B，Jin C，Xu Y，et al.Effect of bone marrow mesenchymal stem cells-derived extracellular matrix scaffold on chondrogenic differentiation of marrow clot after microfracture of bone marrow stimulation in vitro[J].Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi，2013，27（4）：464.

[15]Jager M，F(xiàn)eser T，Denck H，et al.Proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells cultured onto three different polymers in vitro[J].Ann Biomed Eng，2005，33（10）：1 348.

[16]Larsen M，Artym W，Green JA，et al.The matrix reorganized：extracellular matrix remodeling and integrin signaling[J].Curr Opin Cell Biol，2006，18（5）：463.

[17]Wu Y，Zhang P，Dai Q，et al.Effect of mechanical stretch on the proliferation and differentiation of BMSCs from ovariectomized rats[J].Mol Cell Biomechem，2013，382（1/2）：273.

[18]Rice KM，Kakarla SK，Mupparaju SP，et al.Shear stress activates Akt during vascular smooth muscle cell reorientation[J].Biotechnol Appl Biochem，2010，55（2）：85.

[19]Song G，Ju Y，Soyama H，et al.Regulation of cyclic longitudinal mechanical stretch on proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J].Mol Cell Biomechem，2007，4（4）：201.

[20]李曉娜，宋關(guān)斌，羅慶.機(jī)械拉伸對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移行為的影響[J].中國生物工程雜志，2012，32（5）：1.

[21]Song G，Luo Q，Xu B，et al.Mechanical stretch-induced changes in cell morphology and mRNA expression of tendon/ligament-associated genes in rat bone-marrow mesenchymal stem cells[J].Mol Cell Biomechem，2010，7（3）：165.

[22]黃桂玲，鄧宇.堿性成纖維細(xì)胞生長因子對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增及分化潛能的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29（11）：2 274.

[23]Yuan S，Pan Q，F(xiàn)u CJ，et al.Effect of growth factors（BMP-4/7&bFGF）on proliferation &osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells[J].Indian J Med Res，2013，138（1）：104.

[24]李斌，張偉，王健，等.體外微團(tuán)培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形成軟骨細(xì)胞[J].中國矯形外科雜志，2009，17（23）：1 819.

[25]蔣柳宏，鄭有華，張志光，等.bFGF 基因轉(zhuǎn)染對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（4）：41.

[26]Lin WP，Chen XW，Zhang LQ，et al.Effect of neuroglobin genetically modified bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on spinal cord injury in rabbits[J].PLoS One，2013，8（5）：e63 444.

[27]Wei LL，Gao K，Liu PQ，et al.Mesenchymal stem cells from Chinese Guizhou minipig by hTERT gene transfection[J].Transplant Proc，2008，40（2）：547.