低氧脅迫下大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸品種篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

王淑芳，楊潤強，顧振新*

（南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 2100 95）

低氧脅迫下大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸品種篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

王淑芳，楊潤強，顧振新*

（南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 2100 95）

比較理想M-7、95-優(yōu)1、蘇青1號和YH-NJ大豆品種培養(yǎng)4 d后的生理生化變化情況，結果表明：YH-NJ的發(fā)芽率、芽長和呼吸強度顯著高于其他品種，發(fā)芽4 d后YH-NJ的蛋白酶活力、游離氨基酸含量的增加量也顯著高于其他品種，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）產量及增加量均為最大。由此篩選出大豆YH-NJ是發(fā)芽富集GABA的良好品種。以YH-NJ為原料，在單因素試驗結果的基礎上，通過正交試驗，得到發(fā)芽大豆富集GABA的最佳培養(yǎng)條件為：正常培養(yǎng)4 d、低氧脅迫培養(yǎng)48 h、培養(yǎng)液pH 5.0、發(fā)芽溫度30 ℃。在此條件下，GABA產量達到1.97 mg/g，是隨機組的1.56 倍。

大豆；發(fā)芽；γ-氨基丁酸；富集；品種篩選；條件優(yōu)化；低氧脅迫

大豆發(fā)芽后，可提高蛋白質和淀粉消化率以及某些限制性氨基酸和維生素等物質含量，同時可降低或消除抗營養(yǎng)因子含量[1]，尤其可富集對人體有生理調節(jié)功能的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，G ABA）等物質[2]。植物正常生長條件下體內GABA產量很低，通常在0.3～32.5 μmol/g之間，但受到熱激、機械損傷、低氧等逆境脅迫或植物激素作用時會提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍[3-4]，機械傷害可在1～5 min內使大豆葉片內的GABA含量提高17 倍，冷激5～15 mi n可使大豆葉片GABA含量提高19 倍。隨著年齡的增大，人體內合成GABA的能力愈來愈低，不能滿足生理需要。因此，提高食品中GABA產量的方法成為研究的熱點。植物中，GABA合成通過谷氨酸直接脫羧和多胺降解途徑，其中谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）分別為關鍵限速酶[5]。低氧處理對發(fā)芽大豆GABA富集的影響已有報道，但是前人研究中在籽粒發(fā)芽初期采用低氧脅迫處理，嚴重抑制大豆芽生長，從而降低了大豆芽菜的生物量[6]。

本實驗以大豆為試材，比較研究了不同品種的大豆在發(fā)芽過程中生理生化特性、蛋白質等營養(yǎng)成分含量變化，篩選發(fā)芽率高、GABA富集量大的品種。以此品種為試材，經減菌化處理后，正常培養(yǎng)4 d，使豆芽生長生物量大量累積，然后進行低氧脅迫處理，研究大豆發(fā)芽條件對其蛋白質、氨基酸和GABA含量變化，之后以GABA為指標通過正交試驗，優(yōu)化出最適富集條件。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆：供試的大豆品種有理想M-7、95-優(yōu)1、蘇青1號和YH-NJ（表1），購自江蘇省農業(yè)科學院；所有大豆籽粒均采收于2013年，置于-20 ℃條件下貯存，備用。

表1 大豆品種編號、特性及產區(qū)Table1 Description of soybean cultivars

1.2 試劑與儀器

GABA標 準品（純度≥99%） 美國Sigma公司；亮氨酸、考馬斯亮藍G-250、茚三酮 國藥集團（上海）化學試劑公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 上海藍季科技發(fā)展有限公司；三乙胺 成都市科龍化工試劑廠；乙腈 上海陸都化學試劑廠。

Orion818型pH測試儀 美國Orion Research公司；755B型分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Agilent 1200液相色譜儀 安捷倫公司；TDL-40B離心機上海安亭科學儀器廠；PYX-DHS-BS型隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3 籽粒發(fā)芽

取30 g不同品種大豆籽粒，用1%的次氯酸鈉水溶液浸泡消毒15 min，去離子水沖洗至pH值中性，于30 ℃黑暗條件下浸泡6 h。浸泡后的籽粒置于24 ℃、相對濕度85%的發(fā)芽機中，以水為培養(yǎng)液發(fā)芽。培養(yǎng)4 d后，用去離子水清洗發(fā)芽籽粒并吸干表面水分，測定發(fā)芽率、芽長、呼吸速率和蛋白酶活性。鮮樣干燥后粉碎過篩，測定可溶性蛋白、游離氨基酸含量等。

1.4 試驗設計

將30 ℃條件下發(fā)芽4 d后的大豆芽菜置于具塞培養(yǎng)瓶（d 5 cm×18.5 cm）中低氧脅迫條件下（通氣量為0.9 L/min）培養(yǎng)，以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（10 mmol/L）作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)期間，每隔12 h更換1 次培養(yǎng)液，直至培養(yǎng)結束。

1.4.1 單因素試驗

低氧脅迫下大豆發(fā)芽富集GABA，待確定的培養(yǎng)條件有培養(yǎng)液pH值、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間。限定培 養(yǎng)液pH值范圍為3.0～6.5，發(fā)芽溫度為22～38 ℃，發(fā)芽時間為0～72 h，進行單因素試驗。

1.4.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，以低氧脅迫條件下培養(yǎng)液pH值、培養(yǎng)溫度與時間為考察因素，以GABA含量為指標，進行正交試驗。

1.5 測定指標與方法

發(fā)芽率：按照國家標準GB/T 5520—85《糧食、油料檢驗 種子發(fā)芽試驗》測定；芽長：采用游標卡尺測量，每30 粒發(fā)芽大豆作為一個樣本；呼吸速率：采用小籃子法測定[7]；蛋白酶活力：參照文獻[8]方法測定，以鮮質量計；水分含量：用105 ℃恒質量法測定；可溶性蛋白含量：采用考馬斯亮藍法測定，以BSA為標準蛋白[7]；游離氨基酸：采用茚三酮溶液顯色法測定，以亮氨酸為標準[7]；GABA產量：參照Bai Qingyun等[9]的方法測定，以干質量計。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每組實驗設3 次重復，結果以±s表示，數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析，設置顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 大豆品種篩選

表2 大豆發(fā)芽過程中主要生理生化指標變 化Table2 Changes in primary physiological and biochemical indexes during soybean germination

發(fā)芽率、芽長、呼吸速率及蛋白酶活力反映了大豆的生長狀況。由表2可知，YH-NJ在發(fā)芽4 d后發(fā)芽率顯著高于其他品種，比發(fā)芽率最低的蘇青1號高28.84%。發(fā)芽4 d后各品種大豆芽長均大于10 cm，且YH-NJ最長，蘇青1號最短。YH-NJ呼吸速率是理想M-7和蘇青1號的1.79 倍、95-優(yōu)1的1.48 倍。供試各品種大豆發(fā)芽后蛋白酶活力均顯著增強，其中YH-NJ的蛋白酶活力增加量最大，達到310.01 U/g，其次為理想M-7、95-優(yōu)1和蘇青1號。由此可見，YH-NJ的生命活動代謝最為旺盛。

由表3可知，供試各大豆品種在發(fā)芽4 d后含水量均達到較高值，YH-NJ、理想M-7、95-優(yōu)1和蘇青1號分別為86.91%、82.45%、81.61%和79.18%。可溶性蛋白在發(fā)芽前后變化不同，理想M-7、95-優(yōu)1和蘇青1號在發(fā)芽4 d后可溶性蛋白含量均高于其未發(fā)芽大豆，而YH-NJ則在發(fā)芽4 d后比未發(fā)芽的可溶性蛋白含量減少了9.37 mg/g。由此可見，大豆發(fā)芽過程中可溶性蛋白既有合成也有分解。發(fā)芽4 d后，各品種游離氨基酸含量明顯增加，其增加量以YH-NJ最高，達到9.39 mg/g；同時，發(fā)芽后YH-NJ的游離氨基酸含量也顯著高于其他品種，比發(fā)芽后95-優(yōu)1中高5.62 mg/g。在發(fā)芽0 d時，各品種GABA產量均較低，在發(fā)芽4 d后均有顯著提高，其中YH-NJ發(fā)芽后GABA產量是發(fā)芽前的29.17 倍，達到840.81 ?g/g，這也顯著高于其他品種發(fā)芽后的含量。表明發(fā)芽過程有利于大豆體內GABA的積累。綜上所述，4 個品種大豆在培養(yǎng)4 d后，YH-NJ的發(fā)芽率、芽長和呼吸強度顯著高于其他品種。與原料相比，發(fā)芽4 d后YH-NJ的蛋白酶活力、游離氨基酸含量的增加量也顯著高于其他品種，GABA產量及增加量均為最大。因此，YH-NJ是大豆發(fā)芽富集GABA的良好品種。

表3 大豆發(fā)芽過程中水和主要含氮物質含量變化Table3 Change in nitrogenous components during soybean germination

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)液pH值的選擇

表4 培養(yǎng)液pH值對大豆芽菜GABA富集的影響Table4 Effect of pH of buffer solution on GABA accumulation in germinating soybean

由表4可知，在培養(yǎng)液pH值為3.0～6.5時，大豆芽長無顯著差別，這表明培養(yǎng)液pH值對大豆芽長無顯著影響。可溶性蛋白含量隨培養(yǎng)液pH值的增加呈先降低后增加再降低的趨勢，在pH 3.0和pH 5.5時可溶性蛋白含量較高，在pH 4.0時含量最低，僅為39.87 mg/g。游離氨基酸含量在pH 3.0～6.5之間呈先增大后減小的變化趨勢，在pH 4.5時達到最大值30.69 mg/g，顯著高于其他pH值條件下的含量。不同培養(yǎng)液pH值對GABA富集的影響不同，低pH 3.0～4.0對GABA的積累有抑制作用，而高pH 6.0～6.5也不利于GABA的富集。當培養(yǎng)液pH值為5.0時，發(fā)芽大豆GABA產量最高（1 580 μg/g）。因此，確定低氧脅迫下大豆發(fā)芽富集GABA培養(yǎng)液pH值為5.0。

2.2.2 發(fā)芽溫度的選擇

表5 低氧發(fā)芽溫度對大豆芽菜GABA富集的影響Table5 Effect of germination temperature on GABA accumulation in germinating soybean

由表5可知，隨發(fā)芽溫度的升高，發(fā)芽大豆芽長呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在38℃時大豆芽長最短，表明34℃以上的高溫條件并不適合大豆生長。在發(fā)芽溫度為22～38℃之間時，可溶性蛋白含量呈上升趨勢，在38℃時含量最多，是22℃時的1.97倍。表明發(fā)芽溫度的升高，有利于可溶性蛋白的積累。GABA產量變化與游離氨基酸相似，均隨發(fā)芽溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在30℃時，GABA產量也達到最大值，而在38℃時其產量最低。表明GABA產量變化和游離氨基酸含量變化基本一致。

2.2.3 發(fā)芽時間的選擇

表6 發(fā)芽時間對大豆芽菜GABA富集的影響Table6 Effect of germination time on GABA accumulation in germinating soybean

由表6可知，隨大豆發(fā)芽時間的延長其芽長逐漸增長，在72 h時值最大；同時，隨著芽長的不斷增長，大豆芽菜腐敗和褐變現(xiàn)象也逐漸明顯。在大豆生命活動中可溶性蛋白是一個合成代謝與分解代謝共同進行的過程，在發(fā)芽0～60 h過程中逐漸降低，60 h時可溶性蛋白含量僅為發(fā)芽0 h的30%，而72 h含量又變?yōu)樵黾?，表明在發(fā)芽60 h前，大豆分解代謝大于合成代謝，而60 h后合成代謝大于分解代謝。隨發(fā)芽時間的延長，大豆芽菜中游離氨基酸含量逐漸增加。發(fā)芽72 h時游離氨基酸含量分別為發(fā)芽0、24、48 h的2.65、1.62、1.37 倍。表明增加發(fā)芽時間，更多的大分子蛋白質逐漸分解為氨基酸等小分子物質。GABA產量在發(fā)芽0～72 h呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在發(fā)芽48 h時達到最大值，是發(fā)芽0 h的1.98 倍，是未發(fā)芽大豆的58.35 倍。表明低氧脅迫下發(fā)芽48 h有利于GABA的富集。

2.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.4.1 正交試驗設計及結果

以GABA產量為指標，選擇影響大豆發(fā)芽富集GABA的主要因素，培養(yǎng)液pH值、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間，進行三因素三水平正交試驗。

表7 正交試驗結果及分析Table7 Orthogonal array design results and analysis

由表7可知，極差分析表明培養(yǎng)液pH值、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間三因素對大豆發(fā)芽富集GABA影響大小順序依次為發(fā)芽時間＞培養(yǎng)液pH值＞發(fā)芽溫度。大豆發(fā)芽富集GABA最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)液pH 5.0、發(fā)芽溫度30 ℃、發(fā)芽時間48 h。

表8 正交試驗結果方差分析Table8 Analysis of variance

由方差分析（表8）可知，培養(yǎng)液pH值和發(fā)芽時間對GABA產量影響顯著（P＜0.05），發(fā)芽溫度對GABA積累的影響極顯著（P＜0.10）。

2.2.4.2 驗證實驗結果

根據(jù)正交試驗結果，分析得到發(fā)芽大豆富集GABA的最佳培養(yǎng)條件為：發(fā)芽機中正常培養(yǎng)4 d，再低氧脅迫培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液pH 5.0，發(fā)芽溫度30 ℃。為了驗證實驗結果的準確性，在正交試驗設計的各因素范圍之內，隨機選擇一組試驗組合（發(fā)芽機中正常培養(yǎng)4 d，再低氧脅迫培養(yǎng)60 h，培養(yǎng)液pH 4.5，發(fā)芽溫度34 ℃），與正交試驗所得最佳試驗組合進行驗證實驗。最佳組合在芽長、游離氨基酸和GABA產量上均高于隨機組合，其中GABA產量也高于正交試驗中的最高含量（1.88 mg/g）。驗證實驗結果進一步證明試驗結果是可靠的。

3 討論與結論

籽粒萌發(fā)時，酶系統(tǒng)形成及激活，貯藏物質降解，為呼吸等生理活動提供底物，表現(xiàn)為籽粒內物質組成和含量發(fā)生變化。薛云皓等[10]研究得出，玉米發(fā)芽期間可溶性蛋白質含量逐漸增加。糙米隨著發(fā)芽時間的延長，可溶性蛋白含量先增加后減少，游離氨基酸含量增加，增加的可溶性蛋白來自于貯藏蛋白的水解和新蛋白合成[11]。本實驗結果表明，大豆發(fā)芽4 d后，不同品種大豆發(fā)芽率、含水量、呼吸速率呈顯著差異，蛋白酶活力升高，可溶性蛋白降低，游離氨基酸含量升高。YH-NJ的生命活動最為旺盛，蛋白酶活力變化大，可溶性蛋白含量高，游離氨基酸合成量多。

籽粒發(fā)芽過程中，蛋白酶活性增強，使難溶的蛋白水解為易溶的小分子蛋白、肽或氨基酸，再將氨基酸運轉到胚的生長部位，然后以不同的方式加以利用，使氨基酸含量和比例以及蛋白質組成發(fā)生變化，此時對人體的營養(yǎng)價值大為提高[1]。GABA作為一種功能性氨基酸，在發(fā)芽過程中得到了積累。發(fā)芽顯著地提高了糙米的GABA產量[12]。房克敏等[13]研究了16 個品種稻米，測定其GABA產量，結果表明發(fā)芽后糙米GABA產量顯著增加，也證實了糙米品種對發(fā)芽后GABA產量變化有很大影響。本實驗結果表明，發(fā)芽能夠增加大豆體內GABA產量，但不同品種大豆間GABA增幅存在差異，YH-NJ增幅量最大，最適宜作為富GABA大豆芽菜食品原料。

植物體內可溶性蛋白和游離氨基酸含量是反映植物代謝情況較為敏感的指標[14]。盧太白等[15]發(fā)現(xiàn)，小麥在低溫脅迫下的生長狀況與游離氨基酸的積累正相關。不同條件下大豆芽菜可溶性蛋白與游離氨基酸含量不同反應了其體內代謝情況不同。

溫度影響籽粒發(fā)芽，還影響酶蛋白質構象、酶與激活劑的親和力及參與酶促反應功能團的解離等[16]。大多數(shù)植物GAD的最適溫度范圍在35～40 ℃，DAO最適溫度為40 ℃[16-17]。糙米發(fā)芽期間隨溫度升高GAD活性被激活，GABA得到積累[18]。通常植物中GAD的最適反應pH值在5.5～6.0之間，DAO的最適反應pH值在6.5左右，表明植物體內GAD在酸性環(huán)境下活性高。由于植物體內L-Glu脫羧，造成反應體系pH值升高，偏離了GAD的最適pH值，使GABA富集速率下降[19-20]。Bai Qingyun等[9]研究表明，粟谷富集GABA的最適pH值為5.8，與GAD的最適pH值相近。李巖等[21]則采用pH 3.19的檸檬酸-磷酸緩沖液富集蠶豆GABA。Carroll等[22]的實驗表明，酸性環(huán)境激活了胡蘿卜細胞的GAD活性，導致GABA積累，當胞質pH值恢復正常后GAD活性降低，這些實驗為植物細胞質pH值變化影響GABA合成提供了證據(jù)。本研究篩選出大豆芽菜富集GABA的最優(yōu)溫度為30 ℃，低于最適溫度，是因為大豆發(fā)芽是生命活動的過程，過高溫度不利生長；最適pH值為5.0，表明植物在微酸性環(huán)境下GAD活性提高。

大豆籽粒發(fā)芽4 d后，YH-NJ的發(fā)芽率、芽長和呼吸強度顯著高于理想M-7、95-優(yōu)1和蘇青1號品種。發(fā)芽4 d后YH-NJ的蛋白酶活力，游離氨基酸增加量也顯著高于其他品種，GABA增加量為最大。YH-NJ是大豆發(fā)芽富集GABA的合適品種。大豆富集GABA的最佳培養(yǎng)條件為：正常培養(yǎng)4 d后，低氧脅迫培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液pH 5.0，發(fā)芽溫度30 ℃。在此條件下，GABA產量達到1.97 mg/g，是隨機組的1.56 倍。

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Cultivar Selection and Culture Condition Optimization for γ-Amino Butyric Acid (GABA) Accumulation in Germinating Soybean under Hypoxia Stress

WANG Shu-fang, YANG Run-qiang, GU Zhen-xin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

After 4-day germination, t he germination percentage, sprout length and respiratory rate of the soybean cultivar YH-NJ were higher than those of all other cultivars tested. The increment of soluble protein, free amino acids and protease activity in YH-NJ sprouts were higher than those of the other cul tivars. The content of (GABA) was increased and its level in YH-NJ sprouts was the highest. Thus, the cultivar YH-NJ was selected for GABA accumulation in further experiments. Using orthogonal design method, the optimal culture conditions for GABA accumulation in 4-day germinated YH-NJ sprouts were determined as germination in a culture solution at pH 5.0 for another 48 h under hypoxia stress at 30 ℃. Under these conditions, the content of GABA was 1.97 mg/g DW, which was 1.56 times higher than the contro l.

soybean; germination; γ-aminobutyric acid (GABA); accumulation; cultivar selection; condition optimization; hypoxia stress

TS214.2

A

1002-6630（2014）21-0159-05

10.7506/spkx1002-6630-201421031

2014-06-03

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401614）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目

王淑芳（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品中功能成分的富集技術。E-mail：2013808120@njau.edu.cn

*通信作者：顧振新（1956—），男，教授，博士，研究方向為生物技術與功能食品。E-mail：guzx@njau.edu.cn