總免疫球蛋白E時(shí)間分辨熒光免疫分析法的建立與評(píng)價(jià)＊

譚玉華，孫寶清

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所／呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510120）

免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）在血清中含量極微，僅占血清免疫球蛋白總量的0.002%，但它卻是引起過(guò)敏反應(yīng)的主要抗體。自1966年日本學(xué)者Ishizaka發(fā)現(xiàn)IgE以來(lái)，開啟了過(guò)敏性疾病研究的新時(shí)代?？侷gE（total IgE，TIgE）的測(cè)定已在臨床廣泛應(yīng)用，它已成為過(guò)敏性疾病診斷與鑒別診斷、寄生蟲感染性疾病、免疫功能障礙相關(guān)性疾病的實(shí)驗(yàn)室評(píng)估指標(biāo)。隨著環(huán)境的改變，在生活中接觸到的食物、藥物、化學(xué)物質(zhì)等越來(lái)越多，過(guò)敏原也就越來(lái)越復(fù)雜多樣，可達(dá)數(shù)千種，而且很隱蔽。雖然目前已有多種國(guó)際先進(jìn)的過(guò)敏原檢測(cè)系統(tǒng)，但仍難將所有過(guò)敏原全部涵蓋。TIgE檢測(cè)對(duì)這類無(wú)法確定具體過(guò)敏原的過(guò)敏癥患者仍具有極大的幫助。TIgE的體外定量檢測(cè)可為判定機(jī)體對(duì)過(guò)敏原的易感性提供了有價(jià)值的信息[1]，TIgE是特應(yīng)性體質(zhì)的客觀指標(biāo)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，血清TIgE水平的高低還與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，測(cè)定TIgE含量有助于對(duì)病情嚴(yán)重程度的判定從而對(duì)急性發(fā)作期臨床治療療程、緩解期預(yù)防性用藥療程進(jìn)行指導(dǎo)[2]。IgE在過(guò)敏性疾病診斷中的作用已獲得公認(rèn)，但血清中IgE的含量較低，特別是新生兒臍帶血中IgE含量極低，必須用靈敏的方法才能正確檢測(cè)。建立一個(gè)高度敏感同時(shí)又非常特異的檢測(cè)系統(tǒng)是開展人IgE抗體免疫調(diào)節(jié)機(jī)理研究的基本前提和難點(diǎn)之一。目前，時(shí)間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA）已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗(yàn)中一項(xiàng)最有發(fā)展前景的分析手段。因此，筆者基于雙抗體夾心法建立了TIgE TRFIA法，并對(duì)其性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）采集靜脈血，樣本如其干擾限超過(guò)試劑盒說(shuō)明書給定范圍或樣本污染等均應(yīng)予以剔除。收集用于方法學(xué)比對(duì)試驗(yàn)預(yù)期偏倚評(píng)估的隨機(jī)樣本共40例，其待測(cè)物濃度應(yīng)覆蓋方法學(xué)的檢測(cè)范圍，且盡可能均勻分布；健康成人樣本來(lái)自健康體檢正常者的血清樣本共20例，用于參考值的轉(zhuǎn)移接收的驗(yàn)證試驗(yàn)；確診為過(guò)敏性疾病患者的樣本80例，用于評(píng)價(jià)TIgE在過(guò)敏患者樣本中的檢出率及方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果間的一致性。

1.2 儀器與試劑 TAKEEN-Ⅰ型TRFIA儀、FWZ-Ⅰ型微量振蕩器、DEM-Ⅲ型全自動(dòng)洗板機(jī)（廣州市豐華生物工程有限公司）；酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；VictorTM2D1420型TRFIA儀（芬蘭Wallac Oy公司）。羊抗人IgE多克隆抗體（深圳菲鵬生物股份有限公司）；鼠抗人IgE單克隆抗體（美國(guó)Advance公司）；人IgE純品（英國(guó)Abcam公司）；牛血清清蛋白（BSA）和Tween20（美國(guó)Sigma公司）；Sepharose CL-6B凝膠（瑞典Pharmacia公司）；96孔微孔板（深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司）；銪（Eu3＋）標(biāo)記試劑盒（芬蘭 Wallac Oy公司）；帶有濾膜的離心管（美國(guó)Millipore公司）；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭蛔灾埔驭?萘甲酰三氟丙酮為主要成分的增強(qiáng)液；自制含0.4%（V／V）的 Tween20為主要成分的 pH 7.8 200 mmol／L Tris-HCl溶液為濃縮洗滌液；自制含10%（V／V）的小牛血清和0.01g／L乙二胺四乙酸二鈉為主要成分的pH 7.8 50mmol／L的Tris-HCl溶液為實(shí)驗(yàn)緩沖液；自制含50g／L BSA的50mmol／L、pH 7.8的Tris-HCl緩沖液為校準(zhǔn)品稀釋液或樣本稀釋液。300mg／mL的IgA、IgG、IgM，160g／L的清蛋白，1 000IU／mL的甲胎蛋白，800IU／mL的類風(fēng)濕因子，低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制品（廣州市豐華生物工程有限公司）；IgE國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（WHO 2ndIRP75／502；5 000IU／安培）（英國(guó)NIBSC）；TIgE檢測(cè)ELISA試劑盒（德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司）。

1.3 方法

1.3.1 校準(zhǔn)品的制備 以 WHO 2ndIRP 75／502為對(duì)照，人IgE純品用含50g／L BSA的50mmol／L、pH 7.8的 Tris-HCl緩沖液定量稀釋成0.0、2.4、12.0、60.0、300.0、1 500.0IU／mL（分別用A～F表示）。

1.3.2 固相反應(yīng)板的制備和最適包被濃度的選擇 將羊抗人IgE多克隆抗體用50mmol／L、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成包被液（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg／mL），在固相微孔板加入100μL抗體包被液，以上濃度各包被1塊，4℃冰箱孵育過(guò)夜，洗滌1次，再每孔中加入含10g／L BSA的50mmol／L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）250μL，37℃恒溫箱孵育2h封閉，甩干后晾干，真空封膜，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用方陣（棋盤）滴定法，在2.0～6.0μg／mL預(yù)包被的反應(yīng)板上，檢測(cè)校準(zhǔn)品A、校準(zhǔn)品F 2個(gè)濃度點(diǎn)的熒光值強(qiáng)度（CPs）。選取校準(zhǔn)品A本底熒光值（N）較低，且校準(zhǔn)品F的檢測(cè)熒光值（P）與N的比值（P／N）最大的包被濃度為最適包被濃度。確定最適包被濃度后按以上方法制備固相反應(yīng)板。

1.3.3 銪標(biāo)記物的制備和最佳稀釋度的選擇 將1mg的鼠抗人IgE單克隆抗體加入Millipore公司的帶有濾膜的離心管中，10 000r／min離心9～10min。再用標(biāo)記緩沖液（50mmol／L、pH 9.3的碳酸鹽緩沖液）重復(fù)洗滌3～5次。將收集到的200μL鼠抗人IgE單克隆抗體和1mg的銪標(biāo)記試劑充分混勻，4℃振蕩反應(yīng)（24±2）h。反應(yīng)液經(jīng)50mmol／L、pH 7.80 Tris-HCl緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱（1cm×30cm）層析，每管2.0mL，A280監(jiān)測(cè)收集第一洗脫峰。合并峰管，根據(jù)Eu3＋標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書所提供的公式計(jì)算標(biāo)記率和回收率。蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為160 000的單克隆抗體的理想標(biāo)記Eu3＋個(gè)數(shù)為6～10個(gè)／蛋白分子。將銪標(biāo)記物用實(shí)驗(yàn)緩沖液按體積比1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000稀釋，檢測(cè)校準(zhǔn)品 A、校準(zhǔn)品F 2個(gè)濃度點(diǎn)的CPs。選取N較低，且P／N最大的稀釋度為銪標(biāo)記物最佳稀釋度。

1.3.4 TIgE TRFIA方法學(xué)的建立 為了盡量避免 HOOK效應(yīng)，選用雙抗體夾心二步法。檢測(cè)方法應(yīng)適用于普通實(shí)驗(yàn)室條件下，反應(yīng)宜選擇室溫20～25℃條件。第1步：在固相微孔反應(yīng)板中依次加入10μL的校準(zhǔn)品或樣本或質(zhì)量控制品，再每孔中加入100μL樣本稀釋液，在室溫條件下振蕩孵育（30、45、60、75min），洗板5次拍干。第2步：在每孔中加入100μL銪標(biāo)記物工作液，在室溫條件下振蕩孵育（30、45、60、75min），洗板5次拍干。然后在每孔中加入100μL增強(qiáng)液，在室溫條件下振蕩（1、2、3、4、5、10、30、40min），將反應(yīng)板放入 TRFIA 儀內(nèi)進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)。選擇檢測(cè)校準(zhǔn)品A～F熒光值接近平衡的反應(yīng)時(shí)間作為最適反應(yīng)時(shí)間。

1.3.5 性能評(píng)價(jià) 參考文獻(xiàn)[3-4]對(duì)劑量-反應(yīng)曲線擬合模型進(jìn)行優(yōu)選。參考NCCLS的指南及有關(guān)文獻(xiàn)[5-14]對(duì)精密度、檢測(cè)低限、線性、準(zhǔn)確度（校準(zhǔn)品核對(duì)試驗(yàn)、回收試驗(yàn)）、特異性（交叉反應(yīng)試驗(yàn)、干擾試驗(yàn)）、參考值確認(rèn)、方法學(xué)比對(duì)等進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 TRFIA測(cè)量所得熒光計(jì)數(shù)采用TRFIA儀上隨機(jī)配備的分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其他統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0和Microsoft Excel軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 銪標(biāo)記鼠抗人IgE抗體的鑒定 銪標(biāo)記鼠抗人IgE抗體A280監(jiān)測(cè)收集，收集銪標(biāo)記物峰（5～8管）。銪標(biāo)記鼠抗人IgE抗體的回收率為92.51%，表明分離純化后的抗體損失較少。以芬蘭Wallac Oy公司標(biāo)準(zhǔn)Eu3＋為參考，銪標(biāo)記物峰的銪標(biāo)記鼠抗人IgE抗體中的Eu3＋含量為6.06μmol／L，蛋白含量為0.72μmol／L，計(jì)算可得平均每個(gè)鼠抗人IgE抗體上連接了8.40個(gè)Eu3＋，達(dá)到了理想的標(biāo)記率。

2.2 方法學(xué)的建立

2.2.1 最適包被濃度和銪標(biāo)記物最佳稀釋度 經(jīng)方陣（棋盤）滴定法，當(dāng)以4.0μg／mL包被反應(yīng)板和銪標(biāo)記物按1∶1 500稀釋時(shí)，本底良好（＜2 000）且校準(zhǔn)品F檢測(cè)熒光值的S／N值趨于最大，因此最適包被濃度為4.0μg／mL，銪標(biāo)記物最佳稀釋度為1∶1 500。

2.2.2 反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 當(dāng)?shù)?、2步的反應(yīng)時(shí)間分別為60min和45min，檢測(cè)校準(zhǔn)品A～F的熒光值趨于“飽和”，曲線斜率趨于最大，表明反應(yīng)趨于完全。解離增強(qiáng)振蕩5min時(shí)，校準(zhǔn)品A～F的熒光值已趨于平衡，表明Eu3＋已從銪標(biāo)記物螯合物上充分解離下來(lái)，與增強(qiáng)液成分形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。

2.2.3 建立劑量-反應(yīng)曲線 按優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)[3-4]，劑量-反應(yīng)曲線擬合優(yōu)選Log＿LogB雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模式及三樣條平滑（SPLINE）擬合時(shí)曲線平滑，擬合程度高，擬合后的曲線的r＞0.990 0，典型的劑量-反應(yīng)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 TIgE TRFIA的劑量-反應(yīng)曲線

2.3 分析性能評(píng)價(jià)

2.3.1 精密度 參考 NCCLS EP5-A文件[5]評(píng)價(jià)，低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制品批內(nèi)和批間檢測(cè)的實(shí)測(cè)值分別為（4.03±0.07）IU／mL和（4.03±0.30）IU／mL，（90.57±1.44）IU／mL和（90.57±5.05）IU／mL，（319.55±5.33）IU／mL 和（319.55±16.70）IU／mL，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)（CV）分別為1.68%和7.33%，1.59%和5.57%，1.67%和5.23%。

2.3.2 檢測(cè)低限 參考文獻(xiàn)[6]評(píng)價(jià)，平行檢測(cè)校準(zhǔn)品A 20次的熒光值（±s）為1 309＋156；95%CI（x±2s）為1 620，在劑量-反應(yīng)曲線上擬合得到的濃度值為0.25IU／mL，優(yōu)于歐蒙TIgE ELISA法試劑的檢測(cè)低限1IU／mL。

2.3.3 線性 參考 EP6-A 文件[7]評(píng)價(jià)，該方法在1.47～1 510.00IU／mL范圍內(nèi)，其線性回歸方程為Y＝0.988 2X-0.068 8，r＝0.999 3（tr＝83.15，v＝9，P＜0.01），見(jiàn)圖2。本方法的線性上限高于歐蒙TIgE ELISA法試劑的線性上限500 IU／mL。

圖2 TIgE TRFIA的線性

2.3.4 校準(zhǔn)品核對(duì)試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[8-9]評(píng)價(jià)，以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋溶液（2.4～1 500.0IU／mL）為對(duì)照，測(cè)定TIgE TRFIA各校準(zhǔn)品，以相對(duì)偏倚±10.00%為可接受范圍；TIgE TRFIA校準(zhǔn)品A～F的實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值的相對(duì)偏倚在-5.57%～7.92%內(nèi)。

2.3.5 回收試驗(yàn) 將1份22IU／mL的常規(guī)檢測(cè)樣本分成3等份（各1mL），在其中2份中分別加入44IU／mL和110IU／mL的血清樣本0.1mL，制成加入濃度分別為4.0IU／mL和10.0IU／mL的2份待回收分析樣本，第3份中加入校準(zhǔn)品稀釋液0.1mL制成基礎(chǔ)樣本血清，回收率在90.00%～110.00%范圍內(nèi)為可接受。檢測(cè)基礎(chǔ)樣本和2份待回收分析樣本的實(shí)測(cè)濃度分別為19.41、24.21IU／mL和29.64IU／mL，2份待回收分析樣本的回收率分別為97.00%和106.75%，平均回收率為101.88%，比例系統(tǒng)誤差為1.88%。

圖3 血紅蛋白對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果的干擾程度

2.3.6 交叉反應(yīng) 參考文獻(xiàn)[9-10]評(píng)價(jià)，檢測(cè)300mg／mL的IgA、IgG、IgM，160g／L的清蛋白，800IU／mL的類風(fēng)濕因子，1 000IU／mL的甲胎蛋白，其實(shí)測(cè)濃度值分別為0.075、0.120、0.120、0.105、0.125IU／mL和0.040IU／mL，均未高于檢測(cè)低限0.25IU／mL，表明對(duì)TIgE TRFIA檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯交叉反應(yīng)。

2.3.7 干擾試驗(yàn) 參考 NCCLS EP7-A2文件[11]評(píng)價(jià)，分別選用低、中、高濃度的血清加入以下干擾物，干擾物質(zhì)溶液與血清分別按體積比1∶9混合，組成系列干擾物濃度，對(duì)照血清加入干擾物相同體積的純化水，采用干擾率為±10.00%作為系統(tǒng)干擾物最高限。樣本中含血紅蛋白（≤18.00g／L），膽紅素（≤818.0mol／L），三酰甘油（≤21.54mmol／L），乙二胺四乙酸鉀（≤2.20mg／mL），草酸鉀（≤2.00mg／mL），肝素（≤15.00U／mL），枸櫞酸鈉（≤21.80mmol／L），氟化鈉（≤1.00mg／mL）對(duì)檢測(cè)結(jié)果干擾率均在±10.00%以內(nèi)，見(jiàn)圖3～10。

圖4 膽紅素對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果的干擾程度

圖5 三酰甘油對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果的干擾程度

圖6 乙二胺四乙酸二鉀對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果的干擾程度

圖7 草酸鉀對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果的干擾程度

2.3.8 HOOK效應(yīng) 將已知濃度的IgE純品稀釋成3.6～15 000.0IU／mL的系列濃度樣品，每稀釋濃度重復(fù)測(cè)定2次后取平均值。該方法檢測(cè)TIgE達(dá)15 000.0IU／mL時(shí)仍未見(jiàn)HOOK效應(yīng)。

2.3.9 參考值驗(yàn)證 歐蒙ELISA法試劑的參考值為100IU／mL（年齡大于16歲）。參考NCCLS C28-A2文件[12]及 WS／T 402-2012[13]，對(duì)參考值進(jìn)行轉(zhuǎn)移接收驗(yàn)證，檢測(cè)20例健康成人樣本，僅有1例結(jié)果（114.96IU／mL）高于100IU／mL，其他19例樣本在29.81～92.91IU／mL間，檢測(cè)值在引用參考區(qū)間的參考個(gè)體數(shù)與總的參考個(gè)體數(shù)的比率為95%，可以直接引用100IU／mL作為TRFIA檢測(cè)成人樣本TIgE的參考值，但是健康人群TIgE水平易受環(huán)境、種族、遺傳、年齡、檢測(cè)方法及取樣標(biāo)準(zhǔn)等因素的影響，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的參考值或參考值驗(yàn)證。

圖8 肝素對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果的干擾程度

圖9 枸櫞酸鈉對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果的干擾程度

圖10 氟化鈉對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果的干擾程度

2.3.10 方法學(xué)比對(duì) 參考NCCLS EP9-A2文件[14]進(jìn)行預(yù)期偏倚評(píng)估試驗(yàn)。參考美國(guó)CLIA′88規(guī)定的類似項(xiàng)目（IgG）的允許誤差（±25%）的1／2（即±12.50%），作為方法學(xué)可比性的臨床接受判斷標(biāo)準(zhǔn)。TIgE TRFIA與歐蒙ELISA平行檢測(cè)40份樣本（14.43～518.81IU／mL）結(jié)果的線性回歸方程為Y＝1.005 6X-0.153 4，r＝0.999 2（tr＝153.99，v＝38，P＜0.01）。選用歐蒙TIgE ELISA說(shuō)明書上的各年齡階段的參考值作為給定值，TRFIA與歐蒙ELISA的測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏倚在-12.22%～0.48%內(nèi)，均在可接受范圍（±12.50%）之內(nèi)。2種方法在80例過(guò)敏性疾病患者樣本中均檢出61例（76.25%）TIgE高于臨界值100IU／mL，2種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性符合率為100%。

3 討 論

目前應(yīng)用于TIgE檢測(cè)的方法有免疫比濁法（ITM）、放射免疫法（RIA）、ELISA法、化學(xué)發(fā)光法（CLIA）、電化學(xué)發(fā)光法（ECLIA）、熒光免疫分析法（FIA）等。ITM是一類均相免疫測(cè)定法，但單純就靈敏度而言，RIA、ELISA及FIA法等均優(yōu)于ITM法。因RIA具有放射性污染的固有缺陷，其市場(chǎng)占有率逐年下降，Gosling[15]在《Clinical Chemistry》發(fā)表的文章統(tǒng)計(jì)，國(guó)際上在免疫分析中采用同位素標(biāo)記所占的比例由1980年的60%下降為1989年的25%，非同位素標(biāo)記由1980年的不足40%上升為1989年的75%，近年來(lái)這個(gè)比例仍在變化。目前，臨床檢測(cè)TIgE常用的仍是ELISA法，但其靈敏度較低，線性范圍較窄，結(jié)果易受操作人員、實(shí)驗(yàn)條件等因素的影響。由于一般FIA法中的本底較高等問(wèn)題，傳統(tǒng)的FIA用于定量測(cè)定有一定困難。CLIA和ECLIA是目前的新型超微量免疫分析技術(shù)，但是CLIA發(fā)光過(guò)程短、樣品不能重復(fù)檢測(cè)、本底高及易受環(huán)境物質(zhì)干擾。ECLIA盡管有一定優(yōu)勢(shì)，但目前儀器和試劑均依賴進(jìn)口，且非開放系統(tǒng)，造成試劑價(jià)格昂貴，儀器成本及維護(hù)費(fèi)用高。近年來(lái)引進(jìn)的熒光酶免疫法Pharmacia CAP變應(yīng)原體外檢測(cè)系統(tǒng)，試劑價(jià)格昂貴，限制了其大量使用。

RIA、ELISA、傳統(tǒng)的FIA均沒(méi)有實(shí)現(xiàn)人們所期待的高靈敏度分析，因此科學(xué)家們努力尋求一種更可靠的標(biāo)記物，自1979年Soini等[16]合成了一種可用于標(biāo)記抗體的“Eu3＋、β-二酮體和EDTA衍生物”的三元混合物作為熒光探針并提出TRFIA理論，他們預(yù)言TRFIA將發(fā)展為新一代以鑭系元素為示蹤物和時(shí)間分辨熒光測(cè)量相結(jié)合的非放射性微量免疫分析技術(shù)。TRFIA因鑭系元素的熒光壽命可達(dá)60～900s，甚至更長(zhǎng)，比普通熒光高數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，在每個(gè)激發(fā)光脈沖過(guò)后，通過(guò)延時(shí)，門寬選擇，并通過(guò)濾光，以達(dá)到消除來(lái)自樣品、試劑及其他的非特異熒光，從而提高靈敏度，又因鑭系元素的激發(fā)光和發(fā)射光之間有一個(gè)較大的stokes位移，這有利于排除其他非特異熒光的干擾，方法的特異性較高。TRFIA將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光和時(shí)間分辨技術(shù)三者相結(jié)合，其靈敏度可達(dá)10-18mol／L。與現(xiàn)在廣泛使用的 RIA、ELISA、FIA、CLIA和ECLIA相比，TRFIA克服了RIA放射性污染的不足、酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定性和定量范圍窄的缺陷、化學(xué)發(fā)光僅能一次發(fā)光、一般熒光標(biāo)記受環(huán)境干擾的難點(diǎn)和電化學(xué)發(fā)光的非直接標(biāo)記等缺點(diǎn)。

本研究應(yīng)用Eu3＋標(biāo)記建立的TIgE雙抗體夾心TRFIA，經(jīng)方法學(xué)評(píng)價(jià)具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）重復(fù)性好；（2）靈敏度高；（3）線性范圍寬；（4）準(zhǔn)確度高；（5）特異性強(qiáng)；（6）與歐蒙 ELISA 比對(duì)檢測(cè)試劑線性范圍內(nèi)的臨床樣本具有良好的相關(guān)性，2種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性符合率為100.00%；在過(guò)敏性疾病患者中的TIgE的陽(yáng)性檢出率達(dá)76.25%。表明TIgE的檢測(cè)在過(guò)敏性疾病篩選試驗(yàn)中是一個(gè)重要參考指標(biāo)，本研究建立的TIgE TRFIA能滿足臨床的需要。

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