不同劑量吉非替尼對博萊霉素所致大鼠肺纖維化影響的比較＊

黃文亭，林采余，韓 睿，王玉波，陳恒屹，盧從華，李 力，何 勇△

（第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所：1.呼吸科；2.胸外科，重慶400010）

吉非替尼是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的一種，目前被廣泛應用于進展或難治性非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）的小分子靶向藥物，具有高選擇性和低毒性的優(yōu)點，在改善晚期NSCLC的近遠期療效與生活質(zhì)量等方面具有令人鼓舞的前景。在臨床診療過程中，間質(zhì)性肺疾?。╥nterstitial lung disease，ILD）是吉非替尼少見但致命的不良反應，全球范圍內(nèi)使用吉非替尼治療NSCLC并發(fā)ILD的總體發(fā)生率約為1%，死亡率高達30%[1-2]。但目前國內(nèi)外有基礎研究認為吉非替尼對博萊霉素誘導的大鼠（或小鼠）肺纖維化有抑制作用，這一結(jié)論與臨床實踐完全相反，故明確吉非替尼對博萊霉素誘導的肺纖維化的影響有利于探索臨床TKI相關性ILD的干預措施[3-5]。

TKI相關性ILD發(fā)病率較低，因此單純用吉非替尼灌胃動物，成功誘導出肺纖維化概率非常低，動物模型建立困難。有研究者證實即使單純大劑量吉非替尼（200mg／kg）灌胃亦不能引起小鼠明顯肺纖維化改變[3-4]。博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化動物模型已較成熟，故采用博萊霉素致大鼠肺纖維化后，以吉非替尼干預博萊霉素所致肺纖維化，觀察其對纖維化的影響是高效、切實可行的辦法。本研究建立了博萊霉素致大鼠肺纖維化模型，探討不同劑量吉非替尼對纖維化的影響及劑量與效應之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取6周齡健康雄性SD大鼠75只（購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心），體質(zhì)量200～210g。吉非替尼購自英國Tocris Bioscience公司。Masson染色試劑盒由福州邁新生物技術公司生產(chǎn)。ELISA試劑盒由武漢優(yōu)爾生公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及分組 將75只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，分為對照組、博萊霉素組、低劑量吉非替尼聯(lián)用組、中劑量吉非替尼聯(lián)用組和高劑量吉非替尼聯(lián)用組，每組15只。將75只SD大鼠分別用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，仰臥固定于鼠板上，頸部去毛后乙醇消毒，縱行切開頸前皮膚，分離組織后暴露氣管。向氣管內(nèi)注入博萊霉素（5mg／kg，5g／L），對照組注入無菌生理鹽水200μL，注射后迅速將動物直立，旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布均勻。各組大鼠于氣管內(nèi)注射當天開始連續(xù)灌胃21d，對照組與博萊霉素組予生理鹽水2mL灌胃，低、中、高劑量吉非替尼聯(lián)用組分別給予相同體積吉非替尼20、90、200mg／kg灌胃。氣管內(nèi)注射后第21天，殺鼠取肺。

1.2.2 肺組織病理學檢查 大鼠左肺以4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片，組織切片進行常規(guī)HE染色及 Masson膠原染色，膠原染色嚴格按照Masson染色試劑盒說明書進行操作。纖維化程度按Ashcroft等[6]的方法進行評分。

1.2.3 肺組織羥脯氨酸含量的測定 采用ELISA方法，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s描述。Ashcroft評分及羥脯氨酸含量比較采用獨立樣本t檢驗，大鼠死亡率組間兩兩比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肺組織病理學檢查 實驗第21天對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯充血、出血、炎癥浸潤和纖維化等。博萊霉素組肺泡間隔明顯增寬，炎癥細胞浸潤，纖維組織增生。低、中劑量吉非替尼聯(lián)用組肺組織病理改變與博萊霉素組表現(xiàn)相近。高劑量吉非替尼聯(lián)用組見組織破壞嚴重，纖維化明顯，肺泡間隔內(nèi)成纖維細胞，上皮下肌成纖維細胞顯著增多，炎癥細胞浸潤，局部實變。組織切片經(jīng)Masson染色后肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色（圖1）。博萊霉素組Ashcroft評分較對照組顯著增高（P＜0.05）；低、中劑量吉非替尼聯(lián)用組Ashcroft評分與博萊霉素組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），高劑量吉非替尼聯(lián)用組評分較博萊霉素組顯著增高（P＜0.05）。5組大鼠肺纖維化病理評分，見表1。

圖1 各組大鼠第21天時肺組織HE染色及Masson染色（×200）

2.2 大鼠肺組織中羥脯氨酸含量的測定 博萊霉素組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量較生理鹽水對照組高（P＜0.05）；低劑量吉非替尼聯(lián)用組肺組織中羥脯氨酸含量與博萊霉素組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；高劑量吉非替尼聯(lián)用組及中劑量吉非替尼聯(lián)用組肺組織中羥脯氨酸含量明顯高于博萊霉素組（P＜0.05），見表1。

表1 Ashcroft評分及羥脯氨酸含量比較（±s）

表1 Ashcroft評分及羥脯氨酸含量比較（±s）

*：P＜0.05，與對照組比較；▲：P＜0.05，與博萊霉素組比較；△：P＜0.05，與中劑量吉非替尼聯(lián)用組比較。

組別 n Ashcroft評分（分）羥脯氨酸含量（μg／g）對照組15 0.32±0.14 126.14±19.83博萊霉素組 15 5.69±0.55* 630.93±27.64*低劑量吉非替尼聯(lián)用組 15 5.72±0.41 616.47±40.97中劑量吉非替尼聯(lián)用組 15 6.26±0.29 701.26±29.27▲高劑量吉非替尼聯(lián)用組 15 8.27±0.83▲ 842.02±34.82▲△

2.3 大鼠一般情況比較 對照組大鼠體格健壯，體質(zhì)量增加明顯，進食及飲水好，毛發(fā)有光澤，活動靈敏，至21d均存活。博萊霉素組、低劑量吉非替尼聯(lián)用組、中劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠體質(zhì)量增加緩慢，精神狀態(tài)較差，毛發(fā)無光澤，活動較少。高劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠在給藥后第3天有8只出現(xiàn)腹瀉，至第5天13只大鼠呈稀水樣便（包括死亡的7只大鼠），21d時仍存活的4只大鼠較其他組大鼠體型明顯瘦弱、毛發(fā)晦暗、精神萎靡、反應遲鈍。

表2 不同時間點大鼠死亡情況[n（%）]

2.4 各組大鼠死亡率比較 各組大鼠7、14、21d死亡率見表2。

3 討 論

動物模型是指用來進行生物學、行為學、自發(fā)或誘發(fā)性病理過程研究，能夠表現(xiàn)一個或多個方面類似人類或其他動物種類的研究模型[7]。作為人類疾病的“復制品”，動物模型應具有再現(xiàn)性好、復制率高等特點。在臨床診療過程中，吉非替尼治療NSCLC并發(fā)相關ILD的發(fā)病率低，單純用吉非替尼灌胃動物再現(xiàn)性差。本研究以博萊霉素建立ILD模型為基礎，予吉非替尼干預，可以觀察到吉非替尼對ILD動物模型肺纖維化程度的影響。因此，該模型是研究TKI相關性ILD的一個可靠的模型。但該模型仍有一定的局限性。博萊霉素誘導的肺纖維化按病理變化可分為4個階段，14～28d為肺間質(zhì)彌漫性纖維化期，故鼠肺纖維化實驗通常需要觀察到14d后，甚至更長[8]。在本動物實驗中，高劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠呈稀水樣便，21d時較其他組大鼠體型明顯瘦弱，死亡率高達73.3%。吉非替尼常見的藥物不良反應中消化道癥狀發(fā)生率高達84.8%，其中腹瀉占43.3%[9]。因此本研究認為，在吉非替尼干預博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化動物實驗中，消化道不良反應是嚴重影響動物存活率，增加非纖維化相關死亡的主要原因。這也是該模型有待解決及提高的方面。

吉非替尼可加重博萊霉素所致大鼠肺纖維化，該動物研究結(jié)果與既往大量臨床實踐中患者服用吉非替尼導致嚴重間質(zhì)性肺炎的情況一致，這進一步肯定了吉非替尼可誘導ILD而非抑制ILD[10]。之前有學者提出，200mg／kg吉非替尼聯(lián)用能抑制博萊霉素誘導的肺纖維化的結(jié)論，探究其原因，可能與纖維化模型建立成功與否及動物數(shù)量多少有關。本研究建立纖維化動物模型采用的是大鼠氣管切開注射博萊霉素的方法，確保了博萊霉素通過氣道進入肺從而致纖維化[11-12]。另一方面，各組動物避免了死亡導致的剩余樣本量太少造成的誤差。

在博萊霉素致纖維化的情況下，高劑量吉非替尼聯(lián)用組大鼠纖維化病理改變明顯加重（P＜0.05），Masson染色示肺組織中膠原沉積明顯增多，肺組織羥脯氨酸含量顯著升高（P＜0.05）。雖然中等劑量吉非替尼聯(lián)用組Ashcroft評分較單純氣道內(nèi)注入博萊霉素組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但羥脯氨酸含量有明顯增加（P＜0.05）。而低劑量吉非替尼聯(lián)用組各項指標與博萊霉素組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。以上研究結(jié)果提示，吉非替尼劑量越大加重纖維化的程度越高，呈劑量-效應關系。吉非替尼在臨床應用中，其推薦劑量為250mg／d，且不因年齡、體質(zhì)量以及基礎疾病等原因?qū)┝窟M行調(diào)整。已有多項臨床研究表明，既往患有低蛋白血癥或肺間質(zhì)纖維化等疾病會增加ILD發(fā)生的風險，其原因是否與吉非替尼血藥濃度增加有關尚不清楚[13]。因此，筆者認為對每天服用250mg推薦劑量吉非替尼并伴有低體質(zhì)量、營養(yǎng)不良或ILD病史的患者，吉非替尼的使用需謹慎。

綜上所述，吉非替尼能加重博萊霉素所致大鼠肺纖維化，且吉非替尼劑量越大，大鼠肺纖維化程度越高。吉非替尼干預博萊霉素所致大鼠肺纖維化是研究TKI-ILD的一個可靠的模型，在此基礎上可進一步探討其效應及發(fā)病機制，探索臨床TKI相關性ILD的干預措施，乃至開發(fā)有效治療藥物。

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