新藤黃酸通過內質網應激誘導人結腸癌HCT116細胞凋亡的研究

戴婷婷，程 卉，蘇婧婧，李慶林

（省部共建新安醫(yī)學教育部重點實驗室 安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心，安徽合肥 230038）

新藤黃酸通過內質網應激誘導人結腸癌HCT116細胞凋亡的研究

戴婷婷，程 卉，蘇婧婧，李慶林

（省部共建新安醫(yī)學教育部重點實驗室 安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心，安徽合肥 230038）

目的 研究新藤黃酸（gambogenic acid，GNA）誘導人結腸癌HCT116細胞凋亡的機制。方法 采用不同濃度的GNA作用細胞24h，對照組是相同濃度GNA加內質網應激抑制劑4－苯基丁酸（4－phenylbutyric acid，4－PBA）共同作用HCT116細胞24h。采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）染色測定兩組細胞增殖抑制率的差異，采用吖啶橙（acridine orange，AO）和溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色觀察細胞的形態(tài)學變化，采用膜聯蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ，AV）－異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）／碘化丙碇（propidium iodide，PI）雙重染色檢測細胞凋亡率。結果 內質網應激抑制劑4－PBA可以緩解GNA對HCT116細胞增殖的抑制作用；AO／EB染色后熒光顯微鏡觀察發(fā)現GNA作用的細胞具有凋亡特征；流式細胞儀檢測顯示4－PBA可降低HCT116細胞的凋亡率。結論 GNA能抑制人結腸癌細胞HCT116增殖，誘導細胞凋亡，其誘導細胞凋亡的作用可能與內質網應激途徑有關。

新藤黃酸；人結腸癌細胞HCT116；細胞凋亡；內質網應激

藤黃作為我國一種傳統(tǒng)的中藥，具有良好的藥用價值。藤黃味酸澀、有毒，具有攻毒蝕瘡、破血散結等功效，主治癰疽、腫毒、頑癬、惡瘡、跌打損傷，創(chuàng)傷出血及燙傷等［1－2］。1984年，呂歸寶［3］從中藥藤黃中提取得到新藤黃酸（gambogenic acid，GNA）。經過研究表明，GNA較藤黃酸具有抗癌譜廣、抗癌作用強和毒性低等特點。細胞凋亡是細胞產生的一種程序性死亡過程，是細胞受損后積極主動發(fā)生的一種應對機體損傷的生理過程。細胞內經典的凋亡途徑主要有死亡受體活化和線粒體途徑，內質網應激介導的凋亡途徑是近年來發(fā)現的新的凋亡途徑。周蘭貞等［4］已經驗證GNA可以通過影響HCT116細胞周期相關蛋白，使細胞阻滯在G0／G1期，進而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。本實驗在此基礎上進一步研究GNA是否通過影響內質網應激途徑發(fā)揮誘導HCT116細胞凋亡的作用，采用內質網應激抑制劑4－苯基丁酸（4－phenyl butyric acid，4－PBA）阻斷人結腸癌細胞HCT116的應激反應，以探究內質網應激在GNA誘導HCT116細胞凋亡中的作用。

1 材料

1.1 細胞 人結腸癌HCT116細胞株：購自中國科學院昆明細胞庫。

1.2 主要藥物及試劑 GNA（亮黃色干燥粉末，純度99.0％，批號2012120101）：由安徽中醫(yī)藥大學藥物化學教研室提供；RPMI－1640培養(yǎng)基干粉：Gibco公司，批號08612；胎牛血清：杭州四季青生物工程公司，批號110117；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：Amresco公司，批號0793；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：Amresco公司，批號201110108662；膜聯蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ，AV）－異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）／碘化丙碇（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒：南京凱基生物公司；4－PBA：Sigma公司，批號STBD2912V；胰蛋白酶：Sigma公司，批號0458；吖啶橙（acridine orange，AO）和溴化乙錠（ethidium bromide，EB）：Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 Olympus CKX41倒置顯微鏡和Olympus BX51熒光顯微鏡：日本Olympus公司；96孔、6孔平底培養(yǎng)板：美國Corning costar公司；SpectraMax M2e酶標儀：美國Molecular Devices公司；MCO－175CO2培養(yǎng)箱：日本三洋公司；JW2502電子分析天平：上海精密科學儀器有限公司；LD4－8型低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；FACS Calibur流式細胞儀：美國Becton Dickinson公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人結腸癌細胞株HCT116用含10％胎牛血清、100U／ml青霉素和100U／ml鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，于5％ CO2、37℃、相對飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3d消化傳代1次。取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制作用 將對數生長的HCT116細胞消化后用RPMI－1640培養(yǎng)基調整為6×104／ml的濃度，再接種于96孔板中，每孔100μl，每組設3個復孔，培養(yǎng)過夜后待細胞貼壁再加入終濃度為2.5、5.0、7.5μmol／L的GNA培養(yǎng)液100μl，GNA與4－PBA聯用組加入2.5、5.0、7.5 μmol／L的GNA和5mmol／L 4－PBA培養(yǎng)液100 μl，空白對照組加入100μl完全培養(yǎng)基。37℃、5％ CO2、相對飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入5.0g／L的MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清液后每孔加入150μl DMSO，震蕩15min后用自動酶標儀檢測570nm波長處的光密度（optical density，OD）值，計算細胞活力。細胞活力＝

2.3 AO／EB染色檢測HCT116細胞的凋亡 取對數生長期的HCT116細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后加入不同濃度GNA繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄去原培養(yǎng)液，再加入新培養(yǎng)基，每孔加入100μg／ml AO染液和100μg／ml EB染液，避光孵育15min，棄原培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3遍后于熒光顯微鏡下檢測。

2.4 流式細胞儀AV－FITC／PI雙染法檢測HCT116細胞凋亡率 取對數生長期的HCT116細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后加入不同濃度GNA繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)基，用冷PBS洗細胞2次，棄去PBS，再用不含有乙二胺四乙酸二鈉的胰酶消化，終止消化，再用PBS洗滌細胞2次，2 000 r／min離心5min，收集1×105細胞。加入400μl的AV－FITC混勻后，4℃條件下作用15min，再加入10μl PI，混勻，避光孵育5min。于1h內采用流式細胞儀檢測HCT116細胞凋亡率。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)型變量采用“均數±標準差（±s）”進行統(tǒng)計學描述。兩組間均數比較采用Dunnett's T3法（方差不齊）或LSD法（方差齊），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 MTT法檢測GNA和4－PBA對人結腸癌細胞HCT116活力的影響 2.5、5.0、7.5μmol／L的GNA作用HCT116細胞24h后，細胞活力隨GNA濃度的增加而明顯降低。4－PBA與各濃度GNA作用HCT116細胞24h與單獨給予GNA組比較，細胞存活力均顯著增高（或P＜0.01）。見圖1。

圖1 GNA和4－PBA對人結腸癌HCT116細胞活力的影響（n＝3）

3.2 熒光顯微鏡觀察HCT116細胞凋亡 5.0 μmol／L GNA作用HCT116細胞24h后，倒置熒光顯微鏡下可見HCT116細胞表現明顯的凋亡現象，而5.0μmol／L GNA與4－PBA聯用可明顯改善細胞的凋亡現象。見圖2。

注：A.空白對照組；B.5.0μmol／L GNA＋4－PBA組；C.5.0μmol／L GNA組。圖2 倒置熒光顯微鏡下各組HCT116細胞凋亡情況（AO／EB雙重染色，0×20倍）

3.3 AⅤ－FITC／PI染色流式細胞儀檢測HCT116細胞凋亡率 2.5、5.0μmol／L的GNA作用HCT116細胞24h后，細胞凋亡率隨濃度增加而增加，而與4－PBA聯用后，細胞的凋亡率明顯下降。見圖3。

圖3 不同濃度GNA和4－PBA聯合作用24h后HCT116細胞凋亡率比較

4 討論

結腸癌是發(fā)生在胃腸道系統(tǒng)中嚴重威脅人類身體健康的惡性腫瘤。在經濟發(fā)達的歐美國家，結腸癌致死率在所有癌癥致死率中排名第二，而在中國，結腸癌發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢。結腸癌早期治療與其他常見癌癥一樣，主要通過手術切除的方式，但術后容易出現轉移和復發(fā)，此時一些化療藥物就對后期治療起到重要作用，但目前針對腫瘤治療的藥物存在不良反應較多以及毒性較大的問題。近年來，中藥在腫瘤治療中顯現出不良反應少、可持續(xù)應用的優(yōu)勢。藤黃就是研究較廣的一種抗腫瘤藥物。GNA是從中藥藤黃中提取的新的抗腫瘤化合物。曲寶璽等［5］通過研究發(fā)現GNA可以顯著抑制小鼠白血病L1210細胞的增殖生長。近年來，本實驗室通過體內、體外實驗證明GNA對人結腸癌細胞HT－29、人白血病細胞K562、人肝癌細胞BEL－7402、人非小細胞肺癌細胞A549和人鼻咽癌細胞CNE－1都具有生長抑制作用［6－8］。

細胞凋亡是細胞產生的一種程序性死亡過程，是細胞受損后積極主動發(fā)生的一種應對機體損傷的生理過程。細胞內經典的凋亡途徑主要有死亡受體活化和線粒體途徑，內質網應激介導的凋亡途徑是近年來發(fā)現的新的凋亡途徑。

內質網是細胞內由精細的膜系統(tǒng)組成的細胞器，是細胞內一些大分子物質如蛋白質和脂質合成的場所，可以調節(jié)胞內蛋白質的折疊和轉運，同時也是細胞內鈣離子水平調節(jié)的重要場所。當外界的一些刺激擾亂內質網中平衡因子時就會中斷蛋白質合成信號，造成內質網內未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的聚集，擾亂內質網穩(wěn)態(tài)，最終導致內質網應激［910］。此時，細胞就會啟動未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）以應對內質網應激對細胞造成的損害。UPR的啟動有利于暫緩內質網內未折疊蛋白反應以及清除錯誤折疊蛋白反應。內質網應激時，UPR通過PKR樣內質網激酶至真核起始因子2α（PKR－like endoplasmic reticulum kinase－eukaryotic initiation factor 2α，PERK－eIF2A）、肌醇需要酶1至X抗原結合蛋白1（inositol－requiring enzyme 1－X－box binding protein－1，IRE1－XBP1）和激活轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）三條信號通路減少內質網內未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的聚集，減輕累積的蛋白質對細胞造成的損害，恢復內質網的穩(wěn)態(tài)，使應激細胞得以存活。但持續(xù)劇烈的內質網應激發(fā)生時就會使UPR的促生存模式轉向促凋亡模式［11－13］。

本實驗通過GNA與內質網應激抑制劑4－PBA聯用研究內質網應激在GNA對人結腸癌細胞HCT116生長的作用。首先采用MTT法研究GNA與4－PBA聯用對細胞的增殖抑制作用，實驗表明：GNA可濃度依賴性地抑制HCT116細胞的生長增殖，而與5.0mmol／L的4－PBA聯用可緩解GNA對細胞的增殖抑制作用。為近一步研究GNA是否誘導細胞凋亡，筆者采用AO／EB熒光染色觀察細胞形態(tài)學變化。正常細胞的細胞膜完整，AO染成均勻一致的綠色，而EB可以把受損的細胞染成橘紅色。實驗結果表明：4－PBA可顯著降低GNA誘導HCT116細胞的凋亡現象。為驗證GNA是通過內質網應激誘導細胞凋亡的，筆者以GNA與4－PBA聯用，AⅤ－FITC／PI雙重染色法用流式細胞儀檢測4－PBA對GNA誘導細胞凋亡的影響。結果顯示：4－PBA與GNA聯用可以顯著降低GNA誘導HCT116細胞的凋亡率，說明GNA可通過內質網應激誘導人結腸癌細胞HCT116凋亡。

［1］明·李時珍.本草綱目：第2冊［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1977：1344.

［2］南京醫(yī)學院.藥材學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1960：1161.

［3］呂歸寶.藤黃中新藤黃的分離及其結構［J］.藥學學報，1984，19（8）：636－639.

［4］周蘭貞，晏烽根，李慶林.新藤黃酸誘導人結腸癌HCT116細胞凋亡的作用機制研究［J］.腫瘤，2011，31（7）：580－584.

［5］曲寶璽，郝曉閣，李德華.藤黃Ⅱ號抗腫瘤作用的實驗研究［J］.中國腫瘤臨床，1991，18（1）：50－52.

［6］Li QL，Cheng H，Zhu GQ，et al.Gambogenic acid inhibits proliferation of A549cells through apoptosis－inducing and cell cycle arresting［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（3）：415－420.

［7］晏烽根，李慶林.新藤黃酸誘導人鼻咽癌細胞CNE－1凋亡以及對p－p38和p－ERK1／2蛋白的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27（3）：355－359.

［8］朱國旗，程卉，王訓翠，等.新藤黃酸體外抑制肺腺癌A549細胞增殖的作用［J］.安徽中醫(yī)學院學報，2011，30（1）：53－56.

［9］Han J，Back SH，Hur J，et al.ER－stress－induced transcriptional regulation increases protein synthesis leading to cell death［J］.Nat Cell Biol，2013，15（5）：481－490.

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［11］Schonthal AH.Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress signaling in cancer［J］.Biochem Pharmacol，2013，85（5）：653－666.

［12］Tabas I，Ron D.Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress［J］.Nat Cell Biol，2011，13（3）：184－190.

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Gambogenic Acid Induces Apoptosis of Human Colon Cancer HCT116 Cells through Endoplasmic Reticulum Stress

DAI Ting－ting，CHENG Hui，SU Jing－jing，LI Qing－lin
（Key Laboratory of Xin'an Medicine Jointly Supported by Ministry of Education and Anhui Province＆Experimental Research Center，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China）

Objective To investigate the mechanism by which gambogenic acid（GNA）induces the apoptosis of human colon cancer HCT116cells.Methods Experimental HCT116cells were treated with 2.5，5.0，and 7.5μmol／L GNA for 24h，while control HCT116cells were treated with 2.5，5.0，and 7.5 μmol／L GNA plus 5μmol／L endoplasmic reticulum stress（ERS）inhibitor 4－phenylbutyric acid（4－PBA）for 24h.The cellular proliferation inhibition rate was measured by methyl thiazolyl tetrazolium assay；the morphological changes of HCT116cells were observed by acridine orange（AO）／ethidium bromide（EB）staining under a fluorescence microscope；the cell apoptosis rate was determined by flow cytometry with annexin V－fluorescein isothiocyanate（FITC）／propidium iodide（PI）double staining.Results The ERS inhibitor 4－PBA reduced the inhibitory effect of GNA on the proliferation of HCT116cells.The AO／EB staining indicated the characteristics of apoptosis in GNA－treated HCT116cells under the fluorescence microscope.The flow cytometry with annexinⅤ－FITC／PI double staining showed that 4－PBA reduced the apoptosis rate of GNA－treated HCT116cells.Conclusion GNA can inhibit proliferation and induce apoptosis in HCT116cells，and it might induce cell apoptosis through ERS.

gambogenic acid；human colon cancer HCT116cell；cell apoptosis；endoplasmic reticulum stress

R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.023

2013－10－29）

安徽省自然科學基金項目（11040606M190）；國家自然基金項目（81173600）

戴婷婷（1987－），女，碩士研究生

李慶林，qinglin＿lee＠hotmail.com