多聚唾液酸(PSA)及其修飾的神經(jīng)粘附分子(PSA-NCAM)對(duì)腫瘤及細(xì)胞信號(hào)通路的影響

王欣，關(guān)鋒

1. 江南大學(xué)，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫214122；

2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122

神經(jīng)粘附分子(Neural cell adhesion molecule,NCAM)是一種大量存在于細(xì)胞膜上的跨膜糖蛋白，含有5個(gè)IgG樣結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)FN3樣結(jié)構(gòu)域(圖1A)，通過同源(NCAM-NCAM)或者異源結(jié)合機(jī)制增強(qiáng)細(xì)胞-細(xì)胞間的粘附作用，并可以促進(jìn)突觸的生成與發(fā)生，改變突觸功效，有利于神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)塑造等[1]。NCAM包括NCAM-120、NCAM-140和NCAM-180 3種亞型，分子量分別為120kDa、140kDa、180kDa。其中，NCAM-120是GPI錨定蛋白；NCAM-140和NCAM-180是兩種跨膜蛋白(圖1A)。NCAM-140和NCAM-180主要在胚胎早期發(fā)育中起作用，引導(dǎo)神經(jīng)元的遷移，在胚胎分化過程中，可以檢測(cè)到NCAM-120的表達(dá)上調(diào)[2]。NCAM的第3、4、5個(gè)IgG樣結(jié)構(gòu)域上共有 6個(gè) N-糖基化位點(diǎn)[3]，NCAM基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾在第5個(gè)IgG樣結(jié)構(gòu)域的第5和第 6個(gè)糖鏈末端修飾大量的多聚唾液酸(Polysialic acid, PSA)，形成多聚唾液酸化的NCAM，即PSANCAM[4](圖 1：A，B)。

唾液酸(Sialic acid, Sia)是一種九碳糖，結(jié)構(gòu)超過了 50種，其核心結(jié)構(gòu)主要為酮基-脫氧壬酮糖酸(Kdn)、Neu、N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac或 NANA)和 N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或 NANG)(圖2)。這些單體組成的線性碳水化合物即為 PSA，其鏈長(zhǎng)聚合度(Degree of polymerization, DP)可達(dá) 2～400不等[5](圖1B)。帶有大量負(fù)電荷的PSA可以降低NCAM的粘附作用，同時(shí)提高細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。一方面，PSA通過控制NCAM的粘附能力在神經(jīng)系統(tǒng)的形成與重建過程中起著重要的作用[6,7]；另一方面，PSA因其空間排列以及聚合度的不同導(dǎo)致其載體-糖脂或糖蛋白的結(jié)構(gòu)差異，一定程度上決定了該糖脂或糖蛋白的功能發(fā)揮[8,9]。PSA-NCAM對(duì)細(xì)胞粘附能力、遷移能力、侵襲能力的作用報(bào)道較多，但PSA對(duì)NCAM的修飾作用進(jìn)而影響細(xì)胞下游信號(hào)通路的作用仍具有潛在研究?jī)r(jià)值[10]。

圖1 NCAM亞型及PSA-NCAM結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 唾液酸的核心結(jié)構(gòu)

1 PSA對(duì)糖蛋白的修飾及與細(xì)胞因子的結(jié)合

PSA對(duì)糖蛋白的修飾作用以及與小分子的結(jié)合作用會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的維持產(chǎn)生影響。

1.1 PSA對(duì)大分子糖蛋白的修飾

脊椎動(dòng)物中有6種糖蛋白可以發(fā)生多聚唾液酸化修飾，分別是魚卵多唾液酸蛋白[11]、NCAM[12]、大鼠腦部鈉離子通道蛋白[12]、人乳 CD36[13]以及人淋巴細(xì)胞神經(jīng)纖毛蛋白-2[14]，其中NCAM被認(rèn)為是研究PSA的模式蛋白。PSA-NCAM富含于各種胚胎組織中，但在絕大多數(shù)成熟組織中NCAM缺乏PSA修飾。PSA在胚胎和成人腦中的功能尚不完全清楚。人的血小板可以表達(dá)無(wú)唾液酸修飾的糖蛋白CD36，而人和鼠的乳汁中表達(dá)多聚唾液酸化的CD36，說明多聚唾液酸對(duì)新生兒的發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)至關(guān)重要[13]。

1.2 PSA與細(xì)胞因子結(jié)合

Ono等[15]推測(cè)PSA可以通過與神經(jīng)因子形成特殊的復(fù)合物而調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)(Neurotransmitters)、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等的活動(dòng)。PSA不僅具有抑制黏附的作用(圖3A)，Ono等還通過“two-complex”模型提出了PSA可能存在的一種新功能，即PSA具有保留與釋放兩種性能(圖3B)：首先，PSA能夠結(jié)合例如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、成纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(Fibroblast growth factor 2, FGF2)和神經(jīng)遞質(zhì)等神經(jīng)活性分子；其次，PSA維持了這種復(fù)合物存在所需要的獨(dú)特微環(huán)境。同時(shí)，PSA也具備調(diào)節(jié)釋放這些分子的功能，但PSA與這幾種分子的互作形式不盡相同：BDNF與PSA形成復(fù)合物后可由 PSA釋放 BDNF而直接遷移至高親和力的受體，轉(zhuǎn)移至哪個(gè)受體取決于這兩個(gè)分子之間的親和力大??；FGF2與PSA-NCAM形成復(fù)合物后，F(xiàn)GF2要通過其他中間體，并不能直接遷移(間接遷移)至FGFR。在上述過程中PSA均參與了信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

圖 3 PSA新功能的可能機(jī)制(參考文獻(xiàn)[15]并修改)

2 腫瘤細(xì)胞中存在PSA再表達(dá)的現(xiàn)象

近期研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)多聚唾液酸化的糖鏈[16]，表明PSA與腫瘤細(xì)胞的粘附性、遷移性和侵襲性等密切相關(guān)[17]。在小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer)、膠質(zhì)瘤(Glioma)、甲狀腺上皮細(xì)胞腫瘤(Thyroid epithelial tumors)、卵巢粒細(xì)胞瘤(Ovarian granulosa)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、腎母細(xì)胞瘤(Wilms’ tumor)和成神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma)等多種惡性腫瘤的病例中，可以檢測(cè)到NCAM的表達(dá)，除了小細(xì)胞肺癌無(wú)明確報(bào)道外，其他幾種惡性腫瘤均伴有PSA-NCAM的表達(dá)[6,18～23]。此外，在胰腺癌病例中，正常的胰腺組織和癌癥組織中都有NCAM的表達(dá)，而PSA-NCAM只表達(dá)于惡性胰腺癌中，在胰島中并沒有被發(fā)現(xiàn)[23]，說明PSA-NCAM與一些惡性腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。Schreiber等[24]對(duì)12例人胰腺癌腫瘤細(xì)胞樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PSA-NCAM與上皮細(xì)胞粘附分子E-cadherin的結(jié)合抑制了E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞粘附，揭示PSANCAM可以直接影響E-cadherin的功能。

3 PSA及NCAM增強(qiáng)細(xì)胞的遷移與侵襲能力易化腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散

細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織，調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動(dòng)。細(xì)胞的遷移能力依賴于細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用，Li等[25]驗(yàn)證了PSA在這一過程中所發(fā)揮的作用。該研究小組以表達(dá)NCAM而不表達(dá)PSA的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH-3T3為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染STX基因可以實(shí)現(xiàn)NIH-3T3細(xì)胞中NCAM 3種亞型的多聚唾液酸化；與對(duì)照組相比，PSA降低NCAM與細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用，與肝素(Heparin)粘附能力增強(qiáng)而與纖連蛋白(Fibronectin, FN)粘附能力減弱，同時(shí)增強(qiáng)了NIH-3T3細(xì)胞的遷移以及侵襲能力。此外，當(dāng)唾液粘蛋白表面大量表達(dá)PSA后，易化了細(xì)胞從原發(fā)腫瘤的脫落，從而轉(zhuǎn)移形成新的病灶[26,27]。研究發(fā)現(xiàn)，PSA可以引起腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，NCAM也有類似引起腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的作用。Colombo等[28]發(fā)現(xiàn)正常的卵巢細(xì)胞并不表達(dá)NCAM，而卵巢癌細(xì)胞卻隨著病程的加劇高表達(dá)NCAM，由此可見，NCAM可以刺激卵巢癌細(xì)胞的遷移與侵襲。

4 PSA與NCAM介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)應(yīng)答

4.1 NCAM或PSA-NCAM通過FGFR信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與粘附能力

FGFR屬于一類新的受體激酶家族，能與FGF和HS形成三元復(fù)合物，也可以與NCAM直接結(jié)合而引發(fā)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與胚胎發(fā)育、血管形成、傷口愈合等一系列生理過程的調(diào)節(jié)[29]。研究表明，NCAM、PSA-NCAM、PSA分別參與FGFR信號(hào)通路以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與粘附[24,25,30,31]。

4.1.1 NCAM介導(dǎo)的FGFR信號(hào)通路

NCAM可以依賴FGFR家族方式激活神經(jīng)突生長(zhǎng)，并伴隨著各種級(jí)聯(lián)信號(hào)的激活。如酪氨酸激酶 p59fyn(Tyrosine kinase p59fyn)、黏著斑激酶(Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、磷脂酶(Phospholipase C)途徑(PLC-γ pathway)、Ras-絲裂原蛋白活化激酶(Ras-mitogen-activated protein kinase)途徑(p42/44 MAPK pathway)的激活等[32～34]。研究證實(shí)，NCAM主要通過調(diào)節(jié)β1-integrin介導(dǎo)的細(xì)胞基質(zhì)粘著力來(lái)參與腫瘤的病變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[32,35]，而NCAM與FGFR結(jié)合不但可以影響FGF介導(dǎo)的信號(hào)通路，還對(duì)細(xì)胞增殖粘附能力起作用[36]。

4.1.2 PSA-NCAM介導(dǎo)的FGFR信號(hào)通路

雖然諸多文獻(xiàn)報(bào)道了NCAM通過FGFR信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的作用，但PSA-NCAM在這一過程中的可能作用仍缺少進(jìn)一步的證據(jù)。Ono等[15]在分別過表達(dá) STX和 PST的 NIH-3T3細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)FGF2介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。該研究小組通過非變性凝膠電泳、凝膠過濾層析和SPR(Surface plasmon resonance)技術(shù)驗(yàn)證了FGF2可以與PSA結(jié)合，條件是PSA最小聚合度為17。與FGF2形成復(fù)合物的HS相比，PSA可以和FGF2形成更大、更復(fù)雜的FGF2低聚物，并同時(shí)與FGF受體相結(jié)合。以上結(jié)果說明，PSA- NCAM與FGF2的結(jié)合方式異于HS，它能直接與FGF2結(jié)合而參與FGF2-FGF受體信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。在研究PSA與FGFR的作用時(shí)，該研究小組發(fā)現(xiàn)PSA不能與FGFR結(jié)合，說明PSA對(duì)FGF- FGFR信號(hào)通路的影響主要通過調(diào)節(jié) FGF2分子在細(xì)胞內(nèi)的濃度水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。

4.1.3 PSA介導(dǎo)的FGFR信號(hào)通路

研究發(fā)現(xiàn)，PSA也可以通過非依賴于NCAM的信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)。Li等[25]闡述了由 PSA介導(dǎo)的細(xì)胞粘附機(jī)制，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 STX的NIH-3T3細(xì)胞中FGFR、FAK、ERK1/2的磷酸化水平顯著提高；而p59fyn的磷酸化水平因ECM中成分而異：肝素可以增強(qiáng) p59fyn的磷酸化水平，F(xiàn)N(Fibronectin)反之，而 VN(Vitronectin)對(duì) p59fyn的磷酸化水平無(wú)影響。PSA介導(dǎo)的細(xì)胞遷移增加的現(xiàn)象可能是由于FGFR、FAK、ERK1/2的活化而引起，而PSA介導(dǎo)的細(xì)胞粘附可能與p59fyn的活化有關(guān)。

4.2 NCAM 在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中通過非依賴于FGFR的信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程被認(rèn)為是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。該過程中，細(xì)胞極性喪失，上皮細(xì)胞表型丟失，而獲得了間質(zhì)細(xì)胞的表型[30,37,38]。

Lehembre等[31]研究了EMT過程中NCAM對(duì)下游信號(hào)通路的影響。EMT發(fā)生前，E-cadherin在細(xì)胞表面的表達(dá)量較高，此時(shí)只有少量的NCAM與FGFR和PLCγ形成復(fù)合物，F(xiàn)GFR發(fā)送NCAM依賴性的信號(hào)，激活Raf-激酶PKCβII，持續(xù)保持MAPK 的活性以及增強(qiáng)細(xì)胞的粘附(圖 4b)。當(dāng)EMT發(fā)生后，E-cadherin發(fā)生功能性缺失，NCAM的表達(dá)量增加，同時(shí)一部分NCAM的表達(dá)重新定位于脂筏中，此時(shí)p59Fyn大量聚集并與NCAM結(jié)合，p59Fyn被磷酸化和激活，它的效應(yīng)物FAK導(dǎo)致形成穩(wěn)定的 β1-integrin介導(dǎo)的黏著斑，致使細(xì)胞延展性和轉(zhuǎn)移性的增強(qiáng)(圖4c)。與NCAM介導(dǎo)的 FGFR的信號(hào)通路比較，由 FGF介導(dǎo)的非NCAM依賴性的 FGFR信號(hào)通路則是通過 FGFs激活PLCγ/PKCα和Ras/Raf/MAPK信號(hào)途徑積累FGFR，最終提高細(xì)胞的粘附和增殖能力(圖4a)。因此，EMT過程影響了 NCAM介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，這種信號(hào)通路轉(zhuǎn)變的認(rèn)識(shí)將有利于人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤惡變過程的分子機(jī)制。

圖4 基于NCAM亞細(xì)胞定位改變的分子機(jī)制(參考文獻(xiàn)[31]并修改)

4.3 PSA與小分子配體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路影響細(xì)胞遷移與粘附能力

在PSA介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答中，與PSA結(jié)合的配體較少，包括 BDNF[39]、組蛋白 H1(Histone H1)[40]、FGF2[15]等。Theis等[41]證明富含丙氨酸的豆蔻?；鞍准っ窩的作用底物(Myristoylated Alanine-rich C Kinase Substrate, MARCKS)也能作為配體直接與PSA相結(jié)合。MARCKS是蛋白激酶C(Protein Kinase C, PKC)的特異性底物蛋白，介導(dǎo)神經(jīng)元表面信號(hào)與肌動(dòng)蛋白的運(yùn)動(dòng)。在明確細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，底物蛋白磷酸化是各種信使系統(tǒng)作用的最后通路，在PKC的作用下，MARCKS發(fā)生磷酸化反應(yīng)，參與跨膜信息傳遞與腦組織的發(fā)育，還在細(xì)胞轉(zhuǎn)移、粘附、分泌，以及細(xì)胞的內(nèi)攝、外放和吞噬中起作用。同時(shí)，PSA還有捕獲兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)的功能，包括多巴胺，可以通過多巴胺受體調(diào)節(jié)Akt信號(hào)通路[42]。

5 唾液酸轉(zhuǎn)移酶STX與PST的檢測(cè)可能成為臨床診斷的重要手段

研究表明，兩種多聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Polysialyltransferases)—ST8SiaII(STX)和 ST8SiaIV(PST)催化NCAM多聚唾液酸鏈的形成[43]。STX和PST在蛋白水平上有59%的同源性[44]，二者可以在NCAM的第五和第六個(gè)糖基化位點(diǎn)上獨(dú)立合成 PSA，或者協(xié)同作用合成更長(zhǎng)的 PSA鏈，其特性比較見表 1。PST基因與STX基因是獨(dú)立調(diào)控的，預(yù)示這兩種酶有著不同的生物學(xué)作用。但是，每一個(gè)唾液酸轉(zhuǎn)移酶在惡性腫瘤發(fā)展中的生物學(xué)作用尚未見報(bào)道。

Tanaka等[6]研究了 24例非小細(xì)胞肺癌(Nonsmall cell lung cancer, NSCLC)病例，發(fā)現(xiàn)表達(dá)PSA的 NSCLC病例中，STX基因在 I期腫瘤中的表達(dá)(4.2%)明顯低于IV期腫瘤(85.7%)，說明STX基因在腫瘤組織中的表達(dá)與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。在NSCLC腫瘤組織中，只有腫瘤發(fā)展至后期STX基因才表達(dá)，然而PST基因在所有病例和正常肺部組織中都有表達(dá)，說明STX基因在NSCLC腫瘤病變過程中起重要作用。因此，STX基因可能是肺癌治療的一個(gè)新目標(biāo)，對(duì)臨床標(biāo)記具有重要的意義。另外，PST的mRNA水平表達(dá)的顯著變化也在胰腺癌病例中得到證實(shí)：所有NCAM表達(dá)陽(yáng)性的胰腺癌腫瘤細(xì)胞都表達(dá)STX和PST兩種基因[24]。PSA的表達(dá)與癌癥分級(jí)相關(guān)，PSA表達(dá)陽(yáng)性的癌癥中病患的5年存活率較低。針對(duì)不同癌癥中STX和PST基因的表達(dá)差異，監(jiān)控病情發(fā)展以及開展預(yù)前預(yù)后的工作已經(jīng)應(yīng)用到臨床檢測(cè)中。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和橫紋肌肉瘤病人的血清檢查中，如果 PSA含量過高，則預(yù)示著有癌轉(zhuǎn)移與惡變的傾向，而STX轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)已經(jīng)成為斷定病患是否患有轉(zhuǎn)移性神經(jīng)母細(xì)胞瘤疾病的標(biāo)志[45]。

表1 STX與PST的特性比較

6 展 望

PSA及PSA-NCAM的研究，不僅對(duì)人們了解癌癥發(fā)生與發(fā)展提供導(dǎo)向作用，更對(duì)臨床工作提供更多的借鑒和指導(dǎo)。PSA還與多種人類重大疾病相關(guān)，例如老年癡呆癥(Alzheimer’s Disease)、抑郁癥、帕金森綜合征和癲癇癥等。老年癡呆癥的標(biāo)志為神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)失調(diào)與突觸丟失，可能存在某些特殊的神經(jīng)化學(xué)類物質(zhì)導(dǎo)致神經(jīng)元退化以及突觸重塑缺陷，研究發(fā)現(xiàn)NCAM影響腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF的濃度水平，進(jìn)而影響老年癡呆癥的發(fā)生[46]。鑒于PSA與人類多種疾病的發(fā)生緊密相關(guān)，對(duì) PSA以及PSA-NCAM的研究，尤其是PSA影響細(xì)胞多種下游信號(hào)通路的研究將成為熱點(diǎn)。PSA通過FGFR信號(hào)通路增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，但也有報(bào)道指出PSA干擾了FGFR介導(dǎo)的細(xì)胞增殖現(xiàn)象[15]。因此，PSA的繁雜空間構(gòu)象以及不同鏈長(zhǎng)的存在形式影響了其載體糖蛋白功能，使PSA在不同的細(xì)胞中行使了不同的作用。PSA不同作用的發(fā)揮很可能存在其他信號(hào)通路的影響，有待深入研究探討。

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