鈣蛋白酶與心血管疾病

葉婷婷 魏 盟

隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的病死率逐漸增高，并成為全球關(guān)注的健康問題。鈣蛋白酶(calpain)屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員。生理狀態(tài)下，calpain參與多種鈣離子調(diào)控的細(xì)胞程序，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞膜融合和血小板激活。在病理狀態(tài)時(shí)，鈣蛋白酶活性異常增強(qiáng)，參與了老年癡呆癥、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、缺血和外傷性腦損傷、癌癥、白內(nèi)障、休克、糖尿病等許多病變［1］。在心血管疾病中，鈣蛋白酶被過度激活后參與了心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭、糖尿病心肌病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。本文對(duì)鈣蛋白酶在心血管疾病中的作用做一綜述。

一、calpain的結(jié)構(gòu)及激活機(jī)制

calpain是由Gordon Guroff等在1964年首次發(fā)現(xiàn)的［2，3］。在人類基因組中，有15種基因 Capnn(n=1，2，3，5～16)編碼鈣蛋白酶的同工酶，各種同工酶有不同的組織分布和功能。鈣蛋白酶1和鈣蛋白酶2在心血管疾病中發(fā)揮著重要功能，都是由80kDa(由Capn1和Capn2基因分別編碼)的催化亞基和30kDa(由Capn4基因編碼)的調(diào)節(jié)亞基組成。根據(jù)結(jié)構(gòu)，催化亞基分為4個(gè)(Ⅰ～Ⅳ)結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)亞基分為2個(gè)(Ⅴ～Ⅵ)結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ是蛋白酶核心，包含了催化三聯(lián)體的殘基:該活性位點(diǎn)的半胱氨酸在結(jié)構(gòu)域Ⅰ，組氨酸/天冬酰胺對(duì)在結(jié)構(gòu)域Ⅱ。結(jié)構(gòu)域Ⅲ包含兩個(gè)Ca2+連接位點(diǎn)和1個(gè)磷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中的C 2-樣結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是通過特殊的靜電作用參與底物識(shí)別來調(diào)節(jié)鈣蛋白酶活性。結(jié)構(gòu)域Ⅳ有5個(gè)“EF手型”(EF hand)結(jié)構(gòu)，前4個(gè)“EF-手型”結(jié)構(gòu)含有Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，第5個(gè)“EF-手型”結(jié)構(gòu)參與鈣蛋白酶的大、小亞基組成異質(zhì)二聚體。結(jié)構(gòu)域Ⅴ包含參加疏水性的甘氨酸殘留物簇，可能與膜的吸附有關(guān)。結(jié)構(gòu)域Ⅵ和Ⅳ的“EF-手型”結(jié)構(gòu)相互作用形成異質(zhì)二聚體，使大、小亞基連接在一起［4，5］。

calpain1和2通常以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加后激活轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜。calpain通過Ca2+激活的調(diào)節(jié)機(jī)制包括兩個(gè)階段。第1階段:結(jié)構(gòu)域的相互作用引起構(gòu)象改變。Ca2+和磷脂質(zhì)連接到鈣蛋白酶，引起30kDa的亞基從80kDa的分離。結(jié)構(gòu)域Ⅰ的自溶水解在激活期間發(fā)生。第2階段:重排催化活性中心。通過結(jié)合兩個(gè)鈣離子到Ⅱa和Ⅱb結(jié)構(gòu)子域，使Ⅱa和Ⅱb靠近在一起，形成一個(gè)功能性催化中心。第2個(gè)階段的發(fā)生僅僅在第1階段構(gòu)象改變后引起。另外，研究發(fā)現(xiàn)calpain1在體外的激活不要求自溶或亞基解離［3，4，6，7］。

二、calpain與心血管疾病

1．calpain與心肌缺血/再灌注損傷:心肌持續(xù)性缺血導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞死亡，早期再灌注能夠減輕心肌缺血的損傷程度，但是缺血的心肌在血管開放后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常，心肌壞死面積擴(kuò)大，心臟破裂甚至死亡。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注心肌損傷過程中，心肌細(xì)胞內(nèi)氧自由基增加、鈉鉀ATP酶激活、Ca2+濃度異常升高，從而引起線粒體 calpain1激活［8］。激活的calpain1將AIF分裂成t-AIF，隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并通過激活多聚ADP核糖聚合酶而增加非caspase依賴的細(xì)胞凋亡。另外，在缺血再灌注過程中，線粒體中calpain1的激活增加的凋亡誘導(dǎo)因子的分裂，細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)因子的減少增加了心臟損傷［9］。以上兩個(gè)過程都可以被 MDL-28170阻止［10］。Chen等［11］在30min缺血和2h再灌注鼠和兔模型中發(fā)現(xiàn)，再灌注引起鈣蛋白酶的激活，導(dǎo)致Bid(BH3家族的唯一成員)的分裂，進(jìn)而Bid調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放能力喪失。細(xì)胞色素C的缺失導(dǎo)致線粒體無法執(zhí)行氧化磷酸化并且增加活性氧產(chǎn)量。最后，與線粒體功能障礙有關(guān)的通透性轉(zhuǎn)換孔不可逆地開放，這種開放與細(xì)胞死亡密切相關(guān)。

2．calpain與高血壓:高血壓會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌細(xì)胞增生、基質(zhì)沉積，繼而引起血管壁增厚和管腔狹窄。Letavernier等［12］制作了高表達(dá)鈣蛋白酶抑制蛋白的轉(zhuǎn)基因鼠模型，并將血管緊張肽Ⅱ緩慢注入該轉(zhuǎn)基因小鼠和野生小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)高血壓。4周以后在野生小鼠心臟和腎皮質(zhì)內(nèi)NF-κB的活性大大增加。相比之下轉(zhuǎn)基因小鼠上述表現(xiàn)明顯減少。calpain已被證明參與NF-κB的激活過程，并認(rèn)為鈣蛋白酶抑制蛋白可能通過減少NF-κB的激活，降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性或減少膠原纖維的沉淀來阻止血管的重構(gòu)。Jiang等［13］在體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)calpain1能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/Smad信號(hào)，引起彈性蛋白降解、堿性磷酸酶激活，降低鈣化抑制劑、骨橋蛋白和骨連接素的表達(dá)。另外，MMP和calpain的激活能夠引起膠原Ⅰ和Ⅲ的沉積、血管壁的鈣化。Sedding等［14］將血管平滑肌細(xì)胞暴露于體外周期性拉伸力，發(fā)現(xiàn)機(jī)械應(yīng)力能使calpain活性增加。通過鈣蛋白酶抑制蛋白或反義寡核苷酸阻止calpain激活可以增加張力誘導(dǎo)的P53表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率的進(jìn)一步增加。calpain通過P53降解特性中和了平滑肌細(xì)胞過度凋亡，證明calpain是血管壁機(jī)械敏感度重構(gòu)過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。

3．calpain與心力衰竭:各種心臟疾病都能引起心力衰竭(HF)，從而使心排出量不能滿足機(jī)體的需求，產(chǎn)生一系列癥狀和體征。Yang等［15］對(duì)39例充血性心力衰竭患者和38例健康對(duì)照組進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在充血性心力衰竭患者的血漿和心臟中血管緊張肽Ⅱ顯著增加，與心室重構(gòu)指數(shù)緊密相關(guān)。另外，心力衰竭的心室組織中calpain顯著上調(diào)，cain/cabin1的分裂增加，CaN激活。Takahashi等［16］將鼠左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎，第2周和第8周鼠左心室肌和右心室肌都出現(xiàn)了m-calpain的表達(dá)增高，并且在第8周后，血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變并顯現(xiàn)慢性心力衰竭的癥狀。若從第2周起，口服3mg/(kg·d)群多普利或1mg/(kg·d)坎地沙坦至第8周，血流動(dòng)力學(xué)改善。服藥的鼠第8周時(shí)mu-calpain和m-calpain都減少，右心室calpastatin含量增加，表明calpain參與了慢性心力衰竭的發(fā)展，群多普利和坎地沙坦能夠抑制calpains的激活，保護(hù)心肌梗死后的心肌。Ahmad等［17］在4h右心室壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)右心力衰竭豬模型中發(fā)現(xiàn)，右心力衰竭與焦點(diǎn)黏附蛋白 talin有關(guān)，使用MDL-28170抑制calpain能夠改善右心室功能失調(diào)、保護(hù)右心室talin。說明鈣蛋白酶抑制可能為臨床治療急性肺心病提供新方法。

4．calpain與糖尿病心肌病:近年，隨著糖尿病發(fā)生率的增高，由糖尿病引起的心臟微血管病變和心肌代謝紊亂受到了人們的關(guān)注。Bajaj等研究了半胱氨酸蛋白酶家族的兩個(gè)成員caspases和calpains在細(xì)胞凋亡中的作用，發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中，calpain1在腫瘤壞死因子-α引起的細(xì)胞凋亡中激活caspase3和多聚ADP核糖聚合酶，并且calpain1在鈣離子超負(fù)荷后分裂細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子［18］。研究表明，Capn4基因的敲除減少了糖尿病心臟中腫瘤壞死因子-α和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β1的表達(dá)［19，20］。Jian等發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞特性Rac1的缺失或使用Rac1蛋白抑制劑能夠使糖尿病心肌梗死后心肌功能恢復(fù)的能力提高。Rac1信號(hào)途徑的中斷阻止了NADPH氧化應(yīng)激和活性氧(ROS)的產(chǎn)生，從而抑制calpain的激活。此外，通過SOD2超表達(dá)抑制線粒體ROS或通過鈣蛋白抑素超表達(dá)抑制calpain活性能夠使糖尿病心肌梗死損傷減少。Li等［19］在STZ誘發(fā)糖尿病鼠模型中，證明calpain的激活能夠引起I κB的降解和NF-κB的激活，NF-κB轉(zhuǎn)錄到細(xì)胞核并轉(zhuǎn)錄促肥厚基因如β-MHC，calpain也能激活磷酸酶(calcineurin)，引起心肌肥厚。研究顯示，NF-κB與心肌纖維化、炎癥有關(guān)。通過生理性鈣蛋白酶抑制劑、鈣蛋白酶-1小干擾RNA或鈣蛋白酶抑素的超表達(dá)，能阻礙高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞或高糖心臟的細(xì)胞凋亡。

5．calpain與心肌梗死:冠狀動(dòng)脈閉塞，血流中斷，部分心肌因嚴(yán)重的持久性缺血而發(fā)生壞死?？砂l(fā)生律失常、休克或心力衰竭。Mani等將小鼠分為兩組，實(shí)驗(yàn)組靜脈內(nèi)給予0．5mg/kg體重calpeptin，相同劑量每天皮下注射1次。對(duì)照組不予處理。4天后將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組制作心肌梗死模型。發(fā)現(xiàn)calpeptin處理組左心射血分?jǐn)?shù)(EF)顯著改善、舒張末期容積(EDV)較未處理組顯著增加。此外，calpeptin能夠減少calpain和caspase的生成，抑制心肌梗死后心肌重構(gòu)和功能障礙。研究表明，活化的calpain通過降解N-鈣黏蛋白來拆卸閏盤間的細(xì)胞-細(xì)胞黏附，并由此促進(jìn)心肌梗死后心室重構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞特異性基因Capn4的敲除導(dǎo)致calpain-1和calpain-2表達(dá)的破壞，也能夠抑制心肌的炎癥和纖維化，并減少心肌梗死后心臟重塑和功能障礙［20］。

三、展 望

綜上所述，calpain的激活在諸多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，其作用機(jī)制主要通過促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，引起心肌細(xì)胞重構(gòu)，促進(jìn)血管重構(gòu)及鈣化等。并且已證實(shí)在細(xì)胞水平及動(dòng)物模型上使用鈣蛋白酶抑制劑能對(duì)心肌缺血/再灌注及高血壓引起的血管損傷中起到良好的保護(hù)作用。但是calpain的病理生理意義及calpain在糖尿病心肌綜合征中的作用仍未被證明。盡管上文中提到的研究沒有進(jìn)行系統(tǒng)的臨床研究，也沒有證據(jù)顯示鈣蛋白酶抑制劑能夠用于治療人類心臟疾病，但是隨著對(duì)calpain研究的深入及病理生理作用的進(jìn)一步闡明，calpain作為心臟疾病的一個(gè)潛在靶點(diǎn)將有望在預(yù)防和治療心臟疾病方面提供新思路。

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