多壁碳納米管抑制RAW264．7巨噬細(xì)胞的吞噬功能

李 慧 祝 紅 閆 莉 谷婧麗 郝 維 曹濟民

碳納米管由石墨烯片卷曲而成，根據(jù)石墨烯片的層數(shù)，可以將碳納米管分為多壁碳納米管(multiwalled carbon nanotube，MWCNT)和單壁碳納米管(single-walled carbon nanotube，SWCNT)。碳納米管重量輕、比表面積大，是研制藥物遞送載體的良好材料，因其展示的較高的穩(wěn)定性和良好的生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出了無限的應(yīng)用前景［1，2］。有研究報道，碳納米管對骨細(xì)胞的增殖分化及骨組織的生成具有明顯的促進作用，能促進神經(jīng)再生和減少神經(jīng)組織瘢痕的產(chǎn)生［3，4］。隨著對碳納米管研究的深入，其生物安全性方面的報道也逐漸受到重視［5～8］。雖然碳納米管對生物有一定的毒性作用，但其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域仍被寄予厚望。目前生物學(xué)界對碳納米管的免疫細(xì)胞效應(yīng)仍知之甚少。本工作以來源于小鼠的RAW264．7巨噬細(xì)胞系作為吞噬細(xì)胞模型，采用熒光素標(biāo)記的大腸桿菌E．coli k-12(FITC-E．coli k-12)作為吞噬體系，重點研究了MWCNT對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響?？紤]到碳納米管的可能毒性與劑量和作用時間的關(guān)系，筆者觀察了不同濃度和不同作用時間的多壁碳納米管的功效。

材料與方法

1．細(xì)胞和試劑:RAW264．7 巨噬細(xì)胞系、Hepes、DMEM(高糖)培養(yǎng)基、雙抗(含青霉素和鏈霉素)及PBS緩沖液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心;胎牛血清購自Gibco公司(USA);6孔板、12孔板等細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自Corning公司(USA);熒光標(biāo)記的大腸桿菌吞噬試劑盒(v6694 Vybrant?Phagocytosis Assay Kit)購自Molecular Probes公司(USA)。

2．流式細(xì)胞術(shù):常規(guī)培養(yǎng)RAW264．7細(xì)胞;選取對數(shù)生長期的RAW264．7細(xì)胞，用0．25%的胰酶消化成單個細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心5min，棄掉上清液，重新加入DMEM完全培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1ml，37℃培養(yǎng)。觀察不同濃度MWCNT對RAW264．7吞噬能力的影響:實驗設(shè)置5個濃度，MWCNT的濃度分別為0(對照組)、10、25、50 和 75μg/ml。另設(shè)流式細(xì)胞術(shù)的陰性對照組(即RAW264．7細(xì)胞吞噬無FITC標(biāo)記的 DH-5α大腸桿菌)。MWCNT與RAW264．7細(xì)胞共同孵育12h。觀察固定濃度(25μg/ml)MWCNT、不同作用時間對RAW264．7細(xì)胞吞噬能力的影響:實驗設(shè)置5個時間點，分別為0(對照組)、4、7、9和24h。另設(shè)流式細(xì)胞術(shù)的陰性對照組。觀察MWCNT對活化的RAW264．7細(xì)胞吞噬能力的影響:實驗設(shè)置5個組，分別為對照組(不加MWCNT，也不加LPS)，LPS組(LPS 10μg/ml)，LPS+MWCNT 25μg/m 組，LPS+MWCNT 50μg/ml組，LPS+MWCNT 75μg/ml組，每組中的相應(yīng)處理因素(LPS，MWCNT)均與RAW264．7細(xì)胞共孵育16h。另設(shè)流式細(xì)胞術(shù)的陰性對照組。觀察RAW264．7細(xì)胞吞噬大腸桿菌:參照熒光素FITC標(biāo)記大腸桿菌吞噬試劑盒的給定方法，解凍0．5ml HBSS緩沖液，并與FITC標(biāo)記的大腸桿菌(E．coli k-12)干粉充分混勻，移入含4．5ml去離子水的棕色瓶中，超聲混勻直至大腸桿菌微粒充分分散，于12孔板中每孔加入20μl微粒，陰性對照組加入不帶熒光標(biāo)記的DH-5α大腸桿菌。然后37℃避光孵育2h，吸棄上清，每孔加入200μl臺盼藍(lán)(pH 4．4)，反應(yīng) 1min 以淬滅多余的E．coli k-12微粒。用PBS洗3次，收集細(xì)胞，加入500μl PBS充分重懸成單細(xì)胞懸液，用200目篩網(wǎng)過濾后，再用Accuri?C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司生產(chǎn))檢測熒光強度。每個樣本獲取10000個細(xì)胞進行分析，已被吞噬的E．coli k-12的熒光強度檢測，采用激發(fā)波長485nm，吸收波長530nm。計算吞噬指數(shù)，即RAW264．7細(xì)胞吞噬FITC-tagged E．coli k-12的平均數(shù)量，用平均熒光強度(MFI)表示:MFI=(FIsample-FInegative)/FInegative。公式中，F(xiàn)Isample表示樣本的熒光強度，即RAW264．7吞噬FITC-E．coli k-12后的熒光強度;FInegative表示陰性對照組的熒光強度，即細(xì)胞吞噬DH-5α后的熒光強度。此外，筆者也關(guān)注了參與吞噬活動的RAW264．7細(xì)胞的百分比情況，用以反映整個RAW264．7細(xì)胞群體中參與吞噬活動的細(xì)胞比例。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:用SPSS 22．0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組比較用分組檢驗，多組比較用方差分析進行統(tǒng)計學(xué)處理。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．MWCNT劑量依賴性地抑制RAW264．7細(xì)胞的吞噬功能:流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖1所示，對照組的RAW264．7細(xì)胞對FITC標(biāo)記的大腸桿菌有一定的吞噬能力。隨著 MWCNT濃度的遞增(10、25、50和75μg/ml)，RAW264．7 細(xì)胞吞噬 FITC-tagged E．coli k-12的量(用平均熒光強度MFI表示)逐漸降低，與對照組相比分別降低了約 17．0%(P＜0．05)、46．6%、62．5%和70．4%(P ＜0．01)。參與吞噬活動的細(xì)胞百分比也從對照組的98．6%降低到 MWCNT 75μg/ml組的92．4%(P ＜0．05)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)顯示MWCNT濃度依賴性地抑制RAW264．7細(xì)胞對大腸桿菌的吞噬能力

2．MWCNT時間依賴性地抑制RAW264．7細(xì)胞吞噬大腸桿菌的能力:隨著MWCNT孵育時間的延長(4、7、9、24h)，RAW264．7 細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌(FITC-E．coli k-12)的量(用平均熒光強度MFI表示)逐漸降低，與對照組相比分別降低了約28．4%、47．8%、63．2% 和 77．1%(P 均 ＜ 0．01)。參與吞噬活動的細(xì)胞百分比也逐漸降低，分別為對照組71．2%、MWCNT 4h 組 69．7%、MWCNT 7h 組65．1%、MWCNT 9h 組 52．0%、MWCNT 24h 組43．4%(P ＜0．05)，詳見圖2。

3．MWCNT對活化的RAW264．7細(xì)胞的吞噬功能的抑制作用:被LPS(10μg/ml)激活的RAW264．7細(xì)胞與靜息RAW264．7細(xì)胞相比，吞噬FITC-tagged E．coli k-12的平均熒光強度(MFI)升高了約2．62倍(P＜0．01)。MWCNT能夠抑制活化的RAW264．7細(xì)胞的吞噬能力，且隨著MWCNT濃度的升高(25、50、75μg/ml)，活化的 RAW264．7 細(xì)胞吞噬大腸桿菌的量逐漸減少;參與吞噬的細(xì)胞百分比也逐漸降低，分別為:對照組64．2%，LPS組91．1%(與對照組相比，P ＜ 0．01)，LPS+MWCNT 25μg/ml組 85．4%，LPS+MWCNT 50μg/ml組 75．2%，LPS+MWCNT 75μg/ml組70．7%(3組分別與LPS單獨作用相比，P均 ＜0．01)，詳見圖3。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)顯示MWCNT時間依賴性地抑制RAW264．7細(xì)胞吞噬大腸桿菌的能力

圖3 MWCNT抑制活化的RAW264．7細(xì)胞的吞噬功能

討 論

隨著碳納米管在工程學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用的迅速普及，人類和動物接觸和攝入碳納米管的概率也在增加，這勢必增加了碳納米管生物危害性的風(fēng)險［9］。生物體對外源性入侵物質(zhì)(如碳納米管)的第一道防線是免疫系統(tǒng)，巨噬細(xì)胞吞噬異物是免除異物傷害的關(guān)鍵因素之一［10］。巨噬細(xì)胞與外源性異物的相互作用有兩個方面，一方面是巨噬細(xì)胞吞噬和清除異物，另一方面是外源性異物(如碳納米管)對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生可能的傷害作用或其他效應(yīng)，而對這種傷害作用或其他效應(yīng)目前所知甚少。有研究發(fā)現(xiàn)，MWCNT聚集在小鼠肺部能夠引起顯著的促纖維化反應(yīng)和炎癥，而且能觸發(fā)RAW264．7細(xì)胞產(chǎn)生H2O［11］2。每天6h將大鼠暴露在MWCNT氣霧劑中，兩周后支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、白蛋白的量明顯增多［12］。也有報道稱，小鼠吸入MWCNT后，肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)MWCNT顆粒，而且一定濃度的MWCNT能夠減弱NK細(xì)胞的功能，導(dǎo)致免疫抑制，如T細(xì)胞依賴的抗體應(yīng)答和T細(xì)胞的增殖能力降低［13］。由此可見，巨噬細(xì)胞在碳納米管引起的機體免疫應(yīng)答起到重要作用。但未見MWCNT對巨噬細(xì)胞吞噬功能影響的報道。

本工作重點研究了多壁碳納米管對小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264．7細(xì)胞的吞噬功能的影響。筆者觀察了不同的MWCNT濃度和不同的MWCNT孵育時間對靜息RAW264．7細(xì)胞吞噬功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)，MWCNT能夠進入RAW264．7細(xì)胞，這與之前的研究結(jié)果相一致［13］。同時筆者發(fā)現(xiàn)MWCNT能夠顯著減弱RAW264．7細(xì)胞吞噬FITC-E．coli k-12的能力，且呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性。研究中筆者還比較了靜息和LPS激活兩種狀態(tài)下，RAW264．7細(xì)胞吞噬功能的變化。結(jié)果顯示，RAW264．7細(xì)胞在沒有受到吞噬刺激因子LPS激活的狀態(tài)下，也具有一定的吞噬能力。用LPS激活的RAW264．7細(xì)胞，其吞噬能力明顯增強，這與預(yù)期和報道的結(jié)果一致［14］。MWCNT能夠削弱LPS對吞噬的刺激作用，即MWCNT同樣能夠抑制激活的RAW264．7細(xì)胞的吞噬能力。

Pisanic等［15］在PC12神經(jīng)細(xì)胞上發(fā)現(xiàn) Fe2O3納米材料對細(xì)胞骨架的破壞作用。Huang等［16］發(fā)現(xiàn)，長棒行單分散介孔碳納米管使微絲斷裂成無序狀而在細(xì)胞膜附近皺縮破壞，從而破壞A375黑素瘤的細(xì)胞骨架。筆者認(rèn)為MWCNT進入巨噬細(xì)胞后可能由于其三維結(jié)構(gòu)的原因，對細(xì)胞骨架產(chǎn)生了一定的影響，進而阻礙了巨噬細(xì)胞吞噬其他物質(zhì)。但MWCNT究竟如何影響吞噬，以及是否與細(xì)胞骨架有關(guān)，尚需進一步探索。

本項研究的主要技術(shù)手段是流式細(xì)胞術(shù)，其優(yōu)勢在于可以精確定量分析。研究結(jié)果提示，MWCNT對巨噬細(xì)胞吞噬功能有抑制作用。這一效應(yīng)在今后的納米生物學(xué)、納米毒理學(xué)和納米醫(yī)學(xué)研究方面應(yīng)引起重視。

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