神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元定向誘導(dǎo)分化方法的研究進展

楊曉青，劉英富，徐云強(綜述)，陳旭義，李建國※(審校)

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦系科，天津300162;3.武警后勤學(xué)院細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，天津300162;4.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津300193)

神經(jīng)干細胞(neural stem cell，NSCs)是一類具有自我更新能力和多種分化潛能的細胞，不僅存在于哺乳動物胚胎腦組織，而且在已發(fā)育成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也存在NSCs，其特點為:具有自我更新能力;具有未分化的原始神經(jīng)細胞的表面標志物;通過不對稱分裂產(chǎn)生除自身以外的其他神經(jīng)細胞;具有遷移能力，能到達損傷或疾病的部位并產(chǎn)生新的神經(jīng)細胞。NSCs具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞的能力，而分化為的神經(jīng)元在神經(jīng)發(fā)育和修復(fù)受損神經(jīng)組織中發(fā)揮重要作用。因此，尋求一種可以使NSCs定向分化為神經(jīng)元的方法是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。

1 生物學(xué)方法

1.1 膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)分子 膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)分子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員之一，對大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergicneurons，DN)有特異性營養(yǎng)作用;可挽救損傷后的DN，促進恢復(fù)及存活，并提高對多巴胺高親和力攝取等作用，有效保護中腦的多巴胺循環(huán)，預(yù)防體內(nèi) DN的退行性病變[1]。陳梅玲等[2]研究也發(fā)現(xiàn)，GDNF可誘導(dǎo) NSCs向 DN分化，并且細胞形態(tài)更成熟，而0.01 ng/L GDNF具有最佳的誘導(dǎo)效率。其機制可能是通過磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸蛋白激酶通道介導(dǎo)對DN存活和分化起作用[3]。

1.2 血管緊張素Ⅱ 血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中主要的活性肽物質(zhì)，主要由血管緊張素原、血管緊張素在水解酶作用下水解產(chǎn)生，具有影響細胞的增殖、生長、凋亡和調(diào)節(jié)炎癥等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能通過其受體介導(dǎo)定向誘導(dǎo)NSCs向DN分化[5]，由于AngⅡ的作用，使沉默甲基磺酸敏感蛋白2基因得到表達，從而誘導(dǎo) NSCs定向分化為DN。并且外源性AngⅡ促進NSCs向DA能神經(jīng)元分化，在400～600 nmol/L水平范圍內(nèi)AngⅡ的誘導(dǎo)效能更顯著;其機制可能與同時促進星型膠質(zhì)細胞分化有關(guān)[6]。

1.3 促紅細胞生成素 促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種含唾液酸的酸性熱穩(wěn)定(80℃)糖蛋白，近年來研究發(fā)現(xiàn)，EPO對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到保護作用，主要是調(diào)節(jié)NSCs的生長、發(fā)育，抗神經(jīng)細胞凋亡等[7-9]。研究表明，EPO可促進體外培養(yǎng)的鼠胚腦皮質(zhì)NSCs增殖，且最佳濃度為0.005 U/L[10]。并且對體外培養(yǎng)鼠胚腦皮質(zhì)NSCs凋亡及分化也有影響，EPO抑制NSCs凋亡促進其向神經(jīng)元分化，通過EPO和EPO受體結(jié)合后，激活蛋白酪氨酸激酶，迅速誘導(dǎo)細胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，控制NSCs的增殖和分化[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，是通過Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路促進其向神經(jīng)元方向分化的，所以其機制仍需進一步探討[12-13]。

1.4 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，BDNF對神經(jīng)元的存活、分化、生長、發(fā)育起重要作用，為腦內(nèi)合成的一種堿性蛋白[14]，BDNF主要通過與酪氨酸激酶受體B結(jié)合而發(fā)揮作用，從而促進NSCs向神經(jīng)元分化作用，但要將NSCs全部定向誘導(dǎo)成神經(jīng)元不是簡單的事件，可能需要許多因素的協(xié)同作用[15]。如聯(lián)合表皮生長因子具有促進NSCs向神經(jīng)元分化的作用，并且當表皮生長因子水平為20 μg/L、血清濃度為10%時，50 μg/L BDNF是促進NSCs分化為神經(jīng)元的較佳濃度。堿性成纖維生長因子也具有增強BDNF促進NSCs向神經(jīng)元分化的作用，但具體機制仍在研究中[16]。

1.5 全反式視黃酸 全反式視黃酸是維生素A(視黃醇)的衍生物，在調(diào)控多種組織和細胞的形態(tài)發(fā)生、增殖、生長發(fā)育、代謝及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面具有廣泛的生物學(xué)作用，是維持生長發(fā)育不可缺少的物質(zhì)。近年來研究表明，全反式視黃酸可以抑制NSCs的增殖并且有助于誘導(dǎo)干細胞的分化，因其可以抵消堿性生長因子對于NSCs的促有絲分裂和分化抑制的能力，從而有助于定向誘導(dǎo)胚胎NSCs分化為神經(jīng)元[17]。

2 物理學(xué)方法

2.1 三維空間結(jié)構(gòu) 目前應(yīng)用體外培養(yǎng)技術(shù)所獲得的NSCs主要是采用“神經(jīng)球”法和單層貼壁的二維培養(yǎng)方式，但是“神經(jīng)球”法培養(yǎng)的NSCs聚集成神經(jīng)球使培養(yǎng)液難以到達內(nèi)部，引起內(nèi)部細胞死亡，而單層貼壁法培養(yǎng)的細胞數(shù)目較少，所以均存在一定的缺陷[18-19]。O'Connor等[20]發(fā)現(xiàn)，將 NSCs接種到Ⅰ型膠原凝膠的三維支架材料中，NSCs能夠增殖并分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，從而實現(xiàn)三維培養(yǎng)。在三維的膠原凝膠中，NSCs可以分化為有功能的神經(jīng)環(huán)路，產(chǎn)生的神經(jīng)元具有神經(jīng)元極性、神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道感受器及興奮性的功能[21]。關(guān)水等[22]發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為 0.5 mg/L 的膠原具有良好的三維多孔結(jié)構(gòu)，將NSCs接種到Ⅰ型膠原凝膠中從而實現(xiàn)“細胞-膠原”的三維培養(yǎng)，證明了NSCs在三維的膠原凝膠中能夠很好地生長增殖并保持干細胞的基本特性，膠原凝膠可以作為構(gòu)建NSCs的三維培養(yǎng)模型。由此得出，三維培養(yǎng)模型更利于NSCs的生存及增殖，但三維空間結(jié)構(gòu)的材料多種多樣，還有待于進一步研究。

2.2 力學(xué)環(huán)境 在一切的細胞微環(huán)境中都存在著一定的力學(xué)因素，在體外構(gòu)建工程化組織時，給予適當?shù)牧W(xué)刺激可促進種子細胞在生物材料內(nèi)的功能活動，可影響細胞的增殖、周期、骨架和分化[23]。主要包括牽張應(yīng)變、剪切應(yīng)力、壓應(yīng)力及重力。不同種類的細胞對不同的應(yīng)力響應(yīng)也不同，近年來研究發(fā)現(xiàn)，機械應(yīng)力可影響 NSCs的增殖與分化[24]。黃秀玲等[25]研究發(fā)現(xiàn)，利用牽張應(yīng)力對培養(yǎng)的NSCs進行力學(xué)加載，可以影響其骨架重排，從而影響細胞的功能和形態(tài)，并且通過在體外培養(yǎng)胚胎NSCs過程中發(fā)現(xiàn)，短期力學(xué)加載可促進NSCs的分化，所以有必要對其進一步研究，以發(fā)現(xiàn)力學(xué)因素影響NSCs的分化方向。

2.3 低氧環(huán)境 大腦齒狀回顆粒區(qū)、腦室下區(qū)及海馬區(qū)NSCs的神經(jīng)發(fā)生可因腦缺血、缺氧而激發(fā)[26]。也有研究表明，在缺氧/缺血時，通過缺氧誘導(dǎo)因子系統(tǒng)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來影響EPO及其受體對中樞神經(jīng)系統(tǒng)實現(xiàn)保護作用[27-30]。而低氧的培養(yǎng)環(huán)境也能利于NSCs向DN的分化和存活[31]。丁繼固等[32]研究發(fā)現(xiàn)，低氧和GDNF聯(lián)合作用可以互相協(xié)同增加誘導(dǎo)效果，對促進NSCs向DN分化有明顯作用。但體外低氧如何在細胞分化中進行基因調(diào)控，并聯(lián)合細胞因子發(fā)揮作用，從而在體外獲得有效且足量的形態(tài)及功能成熟的DN，將進一步探討。

3 中藥誘導(dǎo)方法

3.1 三七總皂苷 三七總皂苷(panax notoginsenosidespns，PNS)具有很強的抗氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用，含人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷R1，它是三七的主要成分，藥效更為突出，它能夠改善腦缺氧，改善能量代謝，保護腦組織，并具有抗衰老的作用，目前已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PNS干預(yù)的DN移植帕金森病大鼠后移植細胞存活率明顯增高，顯示PNS具有抗細胞凋亡從而保護移植區(qū)DN的作用[33]。張建平等[34]也發(fā)現(xiàn)并初步證實了PNS在合適的劑量下能夠影響體外培養(yǎng)的大鼠海馬NSCs向神經(jīng)元方向分化，其具體作用機制是否與其改善神經(jīng)功能作用有關(guān)，仍有待進一步研究。

3.2 靈芝孢子粉 靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細小的孢子，為靈芝的生殖細胞，薈萃了靈芝的精華部分[35]。它的藥理作用包括對心血管系統(tǒng)的保護作用，抗癌作用，延緩衰老，并且對神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜和保護的作用等。李艷君等[36]研究也發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子粉可以調(diào)控與NSCs增殖過程密切相關(guān)的內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進NSCs向神經(jīng)元的定向誘導(dǎo)分化，進一步促進新生神經(jīng)元軸突的生長。

3.3 其他 近年來隨著中醫(yī)藥方面的發(fā)展，研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，中藥對NSCs的分化有一定的影響作用，除上述外，還包括紅景天苷、黃芩苷和丹酚酸B等，均可誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分化，但其機制仍需進一步研究[37]。

4 結(jié)語

目前，脊髓損傷，腦出血、腦外傷、腦腫瘤術(shù)后導(dǎo)致的神經(jīng)損傷再生修復(fù)是臨床上的一大難題，NSCs分化成的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞為此帶來了希望。但其體外NSCs的誘導(dǎo)分化受到多種因素的影響，如何在體外創(chuàng)造適合的微環(huán)境使其向神經(jīng)元方向分化，并提供有效的營養(yǎng)因子促使其生長，是目前研究的主要問題。雖然目前體外誘導(dǎo)方法很多，但仍沒有一種可以準確誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化的方法，所以找到可控的NSCs向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法為臨床患者帶來希望，仍是未來的研究方向。

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