雙水相法萃取分離豬胰α-淀粉酶體系的初步研究

劉 英，向 迪，倪浩翔，趙豐麗，2*

（1.廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541004；2.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004）

豬胰α-淀粉酶（pig pancreaticα-amylase）是由豬胰腺分泌的一種能夠水解α-1,4-糖苷鍵的酶，目前廣泛應(yīng)用于紡織業(yè)、畜牧業(yè)、制藥工業(yè)等。但是，目前市場上的α-淀粉酶的主要來自于國外進口的微生物發(fā)酵產(chǎn)品，其制備成本較高，提取條件相對復雜，并且α-淀粉酶得率很低[1]。豬胰臟作為α-淀粉酶的提取原料來源充足，而且豬胰α-淀粉酶與人胰α-淀粉酶更為接近，兩者的分子質(zhì)量均為46 ku，最適pH值均為6.7～7.0[2]。在藥物機理研究或某些治療性藥物研發(fā)中，豬胰α-淀粉酶相對于微生物來源的α-淀粉酶具有更強的優(yōu)勢[3]。另外，由于豬胰臟口感不佳，不受大眾喜歡，很多屠宰場是直接丟棄的。豬胰臟作為胰α-淀粉酶的制備原料，價格低廉，生產(chǎn)成本低。

雙水相萃?。╝queous two-phase extraction，ATPE）技術(shù)是一種分離純化某些生物大分子的有效方法。在蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離純化等方面應(yīng)用廣泛，是一種有很大發(fā)展?jié)摿Φ囊子诠I(yè)化應(yīng)用的生物分離技術(shù)[4]。雙水相系統(tǒng)通常是由水溶性的兩種聚合物組成的或者是一種鹽與一種水溶性聚合物組成的體系[5]。與傳統(tǒng)的分離純化技術(shù)相比，雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)具有以下優(yōu)勢：萃取環(huán)境溫和，體系中聚合物對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定和保護的作用；體系中含水量極高，一般在80%以上，同時聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和硫酸鹽溶液均具有維持生物分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，因此蛋白質(zhì)在雙水相體系中不易變性；易于連續(xù)操作和生產(chǎn)工藝放大，該系統(tǒng)甚至可直接放大40 000倍；處理容量大，能耗低；不存在有機溶劑殘留，PEG是化妝品中的常見成分，對生物分子及人體均無危害[6]。目前已經(jīng)有多種蛋白質(zhì)、核酸、病毒和抗生素等通過雙水相進行了成功的分離[7-10]。1956年，瑞典科學家ALBERTSSON P A[11]首次采用雙水相萃取法分離純化生物大分子，考察了生物大分子在雙水相系統(tǒng)中的分配行為，為雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)。20世紀70年代以后，HUSTEDT H等[12]開始嘗試將雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。1980年以后，國內(nèi)也開展了相關(guān)的研究，楊基礎(chǔ)等[13]采用聚乙二醇/磷酸鹽雙水相體系成功的從枯草桿菌發(fā)酵液中提取到α-淀粉酶。郅文波等[14]成功構(gòu)建了α-淀粉酶的雙水相系統(tǒng)純化模型，為雙水相系統(tǒng)的研究提供了理論基礎(chǔ)。

本研究以價格低廉、來源廣泛的豬胰臟作為制備原料，采用PEG1500/（NH4）2SO4雙水相體系對豬胰α-淀粉酶分離條件進行研究，以期為工業(yè)提取胰α-淀粉酶提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰臟：廣西桂林環(huán)城北二路屠宰場，廣西師范大學生命科學院發(fā)酵工程實驗室4 ℃保存；PEG400、PEG1500、PEG4000：錦山化工有限公司；硫酸銨[（NH4）2SO4]：廣州市德松化工有限公司；甲醛、硫酸（H2SO4）、氫氧化鈉（NaOH）：汕頭市西隴化工有限公司；磷酸鈉：浙江東越化工有限公司；可溶性淀粉：天津市基準化學試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：廣州市榕晟化工有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS223S型電子天平：北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HWS-26型恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計：日本島津公司；XL.39-YYQ移液槍：加拿大BBI公司；TDL-80-2B型飛鴿低速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 雙水相體系中水分含量的測定[15]

水分含量測定采用烘箱干燥法：雙水相體系總液經(jīng)電子天平測質(zhì)量后放入烘箱中80 ℃烘干至質(zhì)量恒定，再次測定其質(zhì)量。雙水相體系的水分含量計算公式如下：

式中：W1為雙水相體系的水分含量，%；m1、m2分別為烘干前后雙水相體系的質(zhì)量，g。

1.3.2 硫酸銨含量的測定[16]

硫酸銨含量的測定采用甲醛法：（NH4）2SO4與甲醛作用，生成六次甲基四胺鹽N4（CH2）6、H2SO4及水，用NaOH標準溶液滴定H2SO4和N4（CH2）6，通過所消耗的NaOH的體積求得H2SO4和N4（CH2）6的量，可推算出（NH4）2SO4的含量，其計算公式如下：

式中：W2為（NH4）2SO4在兩相中的含量，g；V為所消耗的NaOH標準溶液的體積，mL；C為NaOH標準溶液的濃度，1 mol/L。

1.3.3 PEG含量的測定[17]

PEG含量的測定參照參考文獻[17]，其計算公式如下：

1.3.4 豬胰α-淀粉酶粗酶液的制備[18]

取解凍后除去雜質(zhì)的豬胰臟50.0 g，剪碎，加50 mL pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液，于均質(zhì)機中常溫下2 000 r/min均質(zhì)5 min，紗布過濾，所得濾液即為α-淀粉酶粗酶液。

1.3.5 豬胰α-淀粉酶酶活力的測定[19]

將0.5 mL粗酶液加入到0.5 mL 1%可溶性淀粉-磷酸鈉緩沖液（20 mmol/L，pH 6.9）中，在25 ℃水浴中反應(yīng)3 min，立即加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸（DNS）顯色劑顯色，用DNS法測定還原糖含量。

酶活力單位定義[20]：在一定條件下，1 min催化產(chǎn)1 μmol還原糖的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.6 PEG/（NH4）2SO4雙水相體系的制備[21]

將不同分子質(zhì)量的PEG和（NH4）2SO4分別溶于蒸餾水，分別制成質(zhì)量分數(shù)為50%的PEG原溶液和（NH4）2SO4原溶液。準確稱取2 mL的PEG原溶液，加入10 mL的刻度試管中，緩慢滴加（NH4）2SO4原溶液，邊滴加邊振蕩混勻，直至試管出現(xiàn)混濁為止，記錄已加入（NH4）2SO4原溶液的體積，計算得加入（NH4）2SO4的質(zhì)量。然后加入0.5 mL的ddH2O，使體系變澄清。重復上述步驟，計算每次體系達到混濁時（NH4）2SO4和PEG在總體系中的質(zhì)量百分比，以PEG的質(zhì)量分數(shù)為縱坐標，（NH4）2SO4的質(zhì)量分數(shù)為橫坐標，得出PEG/（NH4）2SO4雙節(jié)線圖。

固定體系總質(zhì)量為10 g（其中粗酶液為5 g，一定質(zhì)量分數(shù)的PEG溶液和（NH4）2SO4溶液共5 g）輕微振蕩混勻后靜置15 min，分相后根據(jù)試管上的刻度讀出上下相的體積（Vt和Vb），用吸管吸取上相和下相液體各1 mL于10 mL的刻度試管中，測出相比和上下相酶活，相比、胰α-淀粉酶分配系數(shù)和萃取率的計算公式如下：[22]

式中：Vt、Vb分別為上下相體積，mL。

胰α-淀粉酶分配系數(shù)

式中：Ct、Cb分別為上下相分配物質(zhì)濃度，mol/L。

式中：R為相比；Ka為胰α-淀粉酶的分配系數(shù)；Y為萃取率，%。

1.3.7 （NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)對胰α-淀粉酶分配行為的影響

固定PEG質(zhì)量分數(shù)不變，pH值為7.0，酶液體積5 mL，分別選取質(zhì)量分數(shù)為8%、10%、12%、14%、16%、18%的（NH4）2SO4組成雙水相體系，測定酶的分配系數(shù)、相比和萃取率。

1.3.8 PEG質(zhì)量分數(shù)對胰α-淀粉酶分配行為的影響

固定（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)不變，pH值為7.0，酶液體積5 mL，選取不同質(zhì)量分數(shù)的PEG組成雙水相體系，測定酶的分配系數(shù)、相比和萃取率。

1.3.9 pH值對胰α-淀粉酶分配行為的影響

固定PEG和（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)均不變，酶液體積5 mL，分別選取pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0組成雙水相體系，測定酶的分配系數(shù)、相比和萃取率。

1.3.10 雙水相法萃取分離豬胰α-淀粉酶體系的正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，優(yōu)化雙水相法萃取分離豬胰α-淀粉酶體系。以酶的分配系數(shù)（Ka）和萃取率（Y）為評價指標，選擇（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)、PEG質(zhì)量分數(shù)和pH值等3個因素，進行L9（33）正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG/（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)雙節(jié)線圖

雙水相的形成條件以及定量關(guān)系可采用相圖的方式表現(xiàn)出來。根據(jù)上下兩相中PEG與（NH4）2SO4的質(zhì)量分數(shù)可在PEG/（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)圖中得到幾個不同的點，依次連接這些點可得到一條順滑的曲線，即為PEG/（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)雙節(jié)線圖。分別選用PEG400、PEG1500、PEG4000和（NH4）2SO4溶液作為雙水相體系支撐物質(zhì)作雙水相系統(tǒng)雙節(jié)線圖，結(jié)果見圖1。

圖1 PEG/（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)雙節(jié)線圖Fig.1 Binodal curves of PEG/(NH4)2SO4aqueous two phase system

由于高聚物的不相容性和硫酸鹽的鹽析作用，一定濃度的PEG與（NH4）2SO4溶液會在水中形成兩相。由圖1可知，PEG分子質(zhì)量越大，其雙節(jié)線的形狀就越不對稱，這是因為同一類聚合物的疏水性隨分子質(zhì)量的增大而增強[23]，當聚合物的分子質(zhì)量減小時，蛋白質(zhì)易分配于富含該聚合物的相。同時VAIDYA B K等[24]認為小分子質(zhì)量的PEG對蛋白質(zhì)的選擇較差，不適合分離。胰α-淀粉酶主要分配在雙水相體系中的上相，由圖1可知，PEG4000形成分相所需的PEG質(zhì)量分數(shù)過高，由于高聚物的不相容性，會造成胰α-淀粉酶在上相中的分配率過低。而PEG400由于分子質(zhì)量過小，會導致核酸及其他雜蛋白在上相的溶解度增加。因此本試驗選擇PEG1500作為雙水相系統(tǒng)的組成成分。

2.2 硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對胰α-淀粉酶分配系數(shù)和萃取率的影響

研究不同質(zhì)量分數(shù)的硫酸銨對胰α-淀粉酶的分配系數(shù)和萃取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.2 Effects of different concentration of (NH4)2SO4on partition coefficient and extraction rate

由圖2可知，固定PEG1500質(zhì)量分數(shù)為20%，同時調(diào)節(jié)雙水相系統(tǒng)pH值為7，在（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)8%～12%，隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)增加，酶的分配系數(shù)也隨之增加。當（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)為12%時，分配系數(shù)Ka達到最高值5.33；之后隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)的增加，分配系數(shù)又逐漸下降。同時萃取率是隨著（（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)增加而呈總體下降趨勢，因此選用分配系數(shù)較大時（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)12%進行后續(xù)試驗。

此外，由于分配系數(shù)均＞1，可見胰α-淀粉酶主要分配在上相[25]。大部分不溶性雜質(zhì)（結(jié)構(gòu)組織蛋白、脂肪等）主要分配在兩相之間，通過離心即可除去。

2.3 PEG1500質(zhì)量分數(shù)對胰α-淀粉酶分配系數(shù)和萃取率的影響

圖3 PEG1500質(zhì)量分數(shù)對分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.3 Effects of different concentration of PEG1500 on partition coefficient and extraction rate

在固定（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)為12%，同時調(diào)節(jié)雙水相系統(tǒng)的pH值為7.0，研究不同質(zhì)量分數(shù)PEG對胰α-淀粉酶的分配系數(shù)和萃取率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著PEG1500質(zhì)量分數(shù)的增大，酶的分配系數(shù)和萃取率均呈增長趨勢，當PEG1500質(zhì)量分數(shù)為18%時，分配系數(shù)Ka和萃取率Y都達到最大值分別為4.88和66.7%；隨著PEG1500質(zhì)量分數(shù)的繼續(xù)增大，其疏水性越來越高，從而導致胰α-淀粉酶向下相轉(zhuǎn)移，分配系數(shù)和萃取率開始呈下降趨勢[26]。因此選用質(zhì)量分數(shù)為18%的PEG1500進行后續(xù)試驗。

2.4 pH值對胰α-淀粉酶分配系數(shù)和萃取率的影響

在固定PEG1500質(zhì)量分數(shù)為18%，（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)為12%時，研究不同pH值對胰α-淀粉酶的分配系數(shù)和萃取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 pH值對分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.4 Effects of pH on partition coefficient and extraction rate

雙水相體系中pH值的變化對于胰α-淀粉酶在兩相中的分配行為影響極大，體系的pH值偏離目的蛋白胰α-淀粉酶的等電點太遠（pH值過大或過?。鶗斐梢鹊矸勖富钚該p失，從而影響酶的分配系數(shù)和萃取率。pH值變化可影響雙水相系統(tǒng)中的硫酸鹽的解離度，從而導致上相跟下相之間的電位差發(fā)生改變，最終使得胰α-淀粉酶在雙水相體系中的分配行為發(fā)生改變[27]。

由圖4可知，隨著pH值的增大，分配系數(shù)和萃取率都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，并且在pH值為7.0時都達到最大值分別為6.01和79.20%。因此，選用pH值為7.0進行后續(xù)試驗。

2.5 雙水相萃取胰α-淀粉酶的正交優(yōu)化試驗

為進一步優(yōu)化雙水相萃取條件，設(shè)定（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)為A，PEG1500質(zhì)量分數(shù)為B，pH值為C，分別以酶的分配系數(shù)（Ka）和萃取率（Y）為評價指標進行3因素3水平正交試驗，結(jié)果見表1和表2。

由表1可知，因素對分配系數(shù)和萃取率影響的主次順序為A＞B＞C，即（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)＞PEG1500質(zhì)量分數(shù)＞pH值，以分配系數(shù)和萃取率為評價指標的最優(yōu)條件均為A2B2C2，即（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)為12%，PEG1500質(zhì)量分數(shù)為18%，pH值為7.0。在此最佳條件下對豬胰α-淀粉酶進行雙水相萃取驗證試驗，其分配系數(shù)和萃取率分別達到8.48和80.25%，α-淀粉酶活為1 690 U/mL。

表1 萃取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果及分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表2 正交試驗結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)對分配系數(shù)的影響達到顯著水平，對萃取率的影響達到了極顯著的水平。PEG1500質(zhì)量分數(shù)對分配系數(shù)的影響不顯著，但對萃取率的影響達到顯著水平。pH值對分配系數(shù)和萃取率的影響均不顯著。

3 結(jié)論

本研究通過正交試驗確定雙水相體系萃取條件為12%（NH4）2SO4，18%PEG1500，pH值為7.0時，對胰α-淀粉酶的萃取效果最好，其分配系數(shù)Ka和萃取率Y分別為8.48和80.25%，α-淀粉酶活為1 690 U/mL。該方法胰α-淀粉酶酶活損失較少，萃取率高，可為胰α-淀粉酶分離純化提供借鑒。

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