蘭州百合高效再生體系的建立

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（1酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，甘肅酒泉 735000；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，甘肅蘭州733000）

蘭州百合高效再生體系的建立

崔興林1秦新惠1*劉 芬2伊萬(wàn)偉1

（1酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，甘肅酒泉 735000；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，甘肅蘭州733000）

以蘭州百合新鮮鱗片為試材進(jìn)行高效再生體系的研究。結(jié)果表明：蘭州百合中層、內(nèi)層鱗片比外層鱗片容易再生不定芽，更適于作為外植體。鱗片在MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上再生頻率最高，可達(dá)90%；不定芽在MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA的增殖培養(yǎng)基上增殖率最高，平均每芽新增芽4.5個(gè)；不定芽在MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1AC的壯苗生根培養(yǎng)基上鱗莖的膨大倍數(shù)最高，生根數(shù)量較多，小苗長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)，移栽后成活率達(dá)98%以上。

蘭州百合；NAA；6-BA；再生體系

蘭州百合〔Lilium．davidii Duch. var. unicolor（Hoog）Cotton〕為百合科百合屬，其鱗莖碩大、潔白如玉、包合緊密、鱗片肥厚、粗纖維少、嚼之無渣，具有很高的食用價(jià)值，在西北地區(qū)產(chǎn)量高、品質(zhì)佳，已成為全國(guó)知名品牌。蘭州地區(qū)約有150年的百合栽植歷史，主要分布在蘭州市南郊的二陰山區(qū)。目前，由于長(zhǎng)期無性繁殖導(dǎo)致病毒病日趨嚴(yán)重，蘭州百合種性退化，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，品質(zhì)和產(chǎn)量下降，亟須進(jìn)行品種改良。建立穩(wěn)定的高效離體再生體系是實(shí)現(xiàn)蘭州百合品種改良的基礎(chǔ)和前提（韓華麗和郭成金，2009；劉靜，2011），本試驗(yàn)利用蘭州百合鱗片誘導(dǎo)分化不定芽，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，探討生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及活性炭對(duì)蘭州百合鱗片再生、不定芽增殖及鱗莖膨大生根的影響，以期建立蘭州百合高效離體再生體系。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2012年6月至2013年11月在酒泉市高科技農(nóng)業(yè)示范園開展。

1.1 材料

試驗(yàn)材料為外形飽滿、顏色潔白、健壯無病蟲害的3 a生蘭州百合鱗莖。剝?nèi)ネ鈱佑袆?chuàng)傷或帶有褐色小點(diǎn)的鱗片，剝?nèi)△[片的外兩層、內(nèi)兩層、中層，沖洗干凈，做好標(biāo)記，用濾紙吸干水分后分別在3～5 ℃低溫條件下預(yù)處理5～7 d，再用70%酒精浸潤(rùn)滅菌30 s，0.2%升汞溶液滅菌8 min，無菌水沖洗后用濾紙吸干水分，切成5 mm×5 mm的小塊，作為誘導(dǎo)培養(yǎng)的外植體。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素對(duì)鱗片再生的影響 以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，添加不同比例的細(xì)胞分裂素（6-BA）和生長(zhǎng)素（NAA），誘導(dǎo)鱗片再生不定芽。6-BA的濃度分別為0.5、1.0 mg·L-1，NAA的濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg·L-1，配置成6種不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；以MS0（不添加6-BA和NAA）為對(duì)照。每處理10瓶，滅菌后每瓶接種5 mm×5 mm的內(nèi)層、中層、外層鱗片各1塊，先進(jìn)行1 d 的黑暗培養(yǎng)，然后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照周期為L(zhǎng)∶D=16 h∶8 h，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃。觀察統(tǒng)計(jì)內(nèi)層、中層、外層鱗片誘導(dǎo)不定芽的情況。鱗片接種后45 d，統(tǒng)計(jì)再生芽數(shù)和不定芽再生頻率。

1.2.2 細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素對(duì)不定芽增殖的影響以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，另分別添加0.5、0.8 mg·L-1的6-BA，再分別加入0.05、0.10、0.50 mg·L-1的NAA，配置成6種不同的增殖培養(yǎng)基。不定芽形成并長(zhǎng)出1～2片葉時(shí)，轉(zhuǎn)接到上述培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽繼代培養(yǎng)，以生產(chǎn)上常用的增殖培養(yǎng)基MS+0.10 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA為對(duì)照。每處理10瓶，滅菌后每瓶轉(zhuǎn)接5個(gè)不定芽，觀察小苗的長(zhǎng)勢(shì)。30 d后統(tǒng)計(jì)新增芽數(shù)。

1.2.3 不同濃度活性炭（AC）對(duì)鱗莖生長(zhǎng)及生根的影響 將增殖生長(zhǎng)30 d后的小苗剪去葉片，不定芽單個(gè)分開，接種到不同濃度AC的壯苗生根培養(yǎng)基MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖上，AC濃度分別為0、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 g·L-1。每處理5瓶，5次重復(fù)，35 d統(tǒng)計(jì)鱗莖生長(zhǎng)及生根情況（王和飛和林應(yīng)耀，2005）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體再生不定芽的形態(tài)學(xué)觀察

蘭州百合外植體接種在培養(yǎng)基上，7 d左右邊緣翹起，變綠；14 d后切口處有褐化現(xiàn)象，近軸面基部傷口處分化出分生組織，形成愈傷組織，鱗片內(nèi)層形成肉眼可見的1～2 mm小突起，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，小突起逐漸變大、顏色逐漸加深；21 d 后小突起逐漸發(fā)育成膨大的不定芽（圖1-a）。繼續(xù)培養(yǎng)14 d，不定芽膨大并開始展葉（圖1-b）。

無論是何種激素配比處理，中層、內(nèi)層鱗片再生頻率均高于外層鱗片，更適于作為外植體。

圖1 蘭州百合外植體

2.2 細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素對(duì)蘭州百合鱗片再生的影響

蘭州百合鱗片在6-BA和NAA不同濃度配比的6種培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)出不定芽，但誘導(dǎo)效應(yīng)不同（表1）。6-BA濃度為0.5 mg·L-1、NAA濃度為0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高，為90.0%，且小苗的長(zhǎng)勢(shì)最好；6-BA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，隨NAA濃度的增加，誘導(dǎo)率雖較高，但分化出的叢芽太過密集，單芽質(zhì)量差，有的還出現(xiàn)畸形、玻璃化等現(xiàn)象，說明NAA濃度過高或過低均不利于不定芽的誘導(dǎo)，且小苗長(zhǎng)勢(shì)一般。

表1 不同激素濃度配比對(duì)蘭州百合鱗片再生的影響

2.3 細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素對(duì)蘭州百合不定芽增殖的影響

將經(jīng)誘導(dǎo)分化的不定芽接種在含6-BA和NAA不同濃度配比的6種增殖培養(yǎng)基上，15 d后長(zhǎng)出新芽。由表2可知，T4處理不定芽增殖率最高，且小苗長(zhǎng)勢(shì)最好。6-BA濃度不變時(shí)，隨著NAA濃度增加，平均每芽新增芽數(shù)也減少；NAA濃度不變時(shí)，隨著6-BA濃度增加，新增鱗芽數(shù)增加，表明較高濃度的細(xì)胞分裂素及較低濃度的生長(zhǎng)素有利于蘭州百合不定芽增殖。

2.4 不同濃度AC對(duì)蘭州百合鱗莖膨大生根的影響

將增殖的健壯不定芽接種在不同AC濃度的培養(yǎng)基上，35 d后均生根（表3），且鱗莖平均鮮質(zhì)量、平均直徑均隨AC濃度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，生長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)為先強(qiáng)后弱，而平均生根數(shù)逐漸下降，但均明顯高于不含AC的處理，說明加入適當(dāng)濃度的活性炭有利于鱗莖的膨大和生根。

表2 不同激素濃度配比對(duì)蘭州百合不定芽增殖的影響

表3 不同濃度AC對(duì)蘭州百合鱗莖膨大生根的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)分別以蘭州百合的內(nèi)層、中層、外層鱗片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)中層鱗片再生的鱗莖最多且較大，內(nèi)層鱗片次之，外層鱗片最差，且外層鱗片機(jī)械損傷嚴(yán)重，病菌多，易于污染。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，外植體在6-BA濃度為0.5 mg·L-1、NAA濃度為0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)45 d后不定芽再生率最高，為90%，且不定芽形成的小苗長(zhǎng)勢(shì)最好，這與李倩中等（2003）得出的6-BA、NAA濃度組合相一致；最適不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA，培養(yǎng)30 d后每個(gè)不定芽可增殖4.5個(gè)，小苗長(zhǎng)勢(shì)壯，這與王剛等（2002）報(bào)道的結(jié)果相一致；將增殖的不定芽接入MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1AC壯苗生根培養(yǎng)基中，35 d后鱗莖略膨大、長(zhǎng)有2～3片葉、生出4～5條根時(shí)移栽，營(yíng)養(yǎng)土配方為珍珠巖∶草炭土=2 V∶8 V，成活率可達(dá)98%以上。

本試驗(yàn)是在基本恒定的環(huán)境條件下開展的，環(huán)境因子與影響鱗片分化、鱗芽增殖、鱗莖膨大的激素濃度和配比的相關(guān)性，培養(yǎng)系統(tǒng)中最佳的環(huán)境與激素組合等問題還需要深入研究。

韓華麗，郭成金．2009．蘭州百合的組織培養(yǎng)．天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，29（3）：62-65．

劉靜. 2011. 蘭州百合快速繁殖研究. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，42（8）：839-842．

李倩中，劉曉青，陳尚平．2003．不同濃度IBA和6-BA對(duì)百合組織培養(yǎng)的影響．南京農(nóng)專學(xué)報(bào)，19（2）：43-45．

王剛，杜捷，李桂英，梁萬(wàn)福，幸亨泰． 2002．蘭州百合和野百合組織培養(yǎng)及快速繁殖研究．西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，38（1）：69-71．

王和飛，林應(yīng)耀．2005．百合組織培養(yǎng)生根的初探．瓊州大學(xué)學(xué)報(bào)，12（2）：24-26．

Establishment of Highly Efficient Regeneration System of Lanzhou Lily

CUI Xing-lin1，QIN Xin-hui1*，LIU Fen2，YI Wan-wei1

（1Biological Engineering Department，Jiuquan Vocational and Technical College，Jiuquan 735000，Gansu，China；2Institute of Woods and Flowers，Gansu Province Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 733000，Gansu，China）

Taking fresh Lanzhou lily〔Lilium. davidii Duch. var. unicolor（Hoog）Cotton〕scale as explant，this paper explored the establishment of highly efficient regeneration system．The results showed that the middle and inner layer of the scales were superior than the outer ones，and more suitable to be explant．The scales regeneration frequency reached the highest in medium of MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，up to 90.0%．A small bud had the highest proliferation rate in the medium of MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA，with an average number of 4.5 per bud new shoots．The medium of MS+0.8 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1AC facilitated the enlargement growth of test-tube plantlets，and their survival rate was over 98% after transplanting．

Lanzhou lily；NAA；6-BA；Regeneration system

崔興林，男，講師，主要從事園藝教學(xué)及科研工作，E-mail：jqzycxl@126.com

*通訊作者（Corresponding author）：秦新惠，女，副教授，主要從事植物組織培養(yǎng)、無土栽培的教學(xué)與研究工作，E-mail：qinxinhui@126.com

2013-12-12；接受日期：2014-01-07

2012酒泉市市列科技計(jì)劃項(xiàng)目