基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記及SSR標(biāo)記的甜瓜主栽品種分類鑒定研究

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記及SSR標(biāo)記的甜瓜主栽品種分類鑒定研究

李瑞峰 高 鵬 朱子成 欒非時(shí)*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記、SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)市場(chǎng)上廣泛種植的甜瓜品種進(jìn)行分類鑒定。利用形態(tài)學(xué)聚類分析，得到60份材料間的相似系數(shù)為0.73～0.94，在相似系數(shù)為0.74處，60份甜瓜材料被分為2類，為薄皮甜瓜和厚皮甜瓜；在相似系數(shù)為0.77處，薄皮甜瓜按照單果質(zhì)量、熟性、果皮底色、芳香氣分為4組，實(shí)現(xiàn)初步分類。經(jīng)過(guò)SSR標(biāo)記聚類分析，得到60份材料間的相似系數(shù)為0.75～0.95，當(dāng)相似系數(shù)為 0.77 時(shí)，可以將所有供試材料分為6類。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，為60份不同甜瓜品種構(gòu)建唯一的指紋圖譜。18對(duì)SSR引物，每對(duì)引物可以檢測(cè)到4～11條數(shù)目不等的多態(tài)性條帶，平均為8條。多態(tài)性信息含量（PIC）平均為0.71，變化范圍為0.58～0.88。采用QR編碼為60份甜瓜材料構(gòu)建了唯一的指紋圖譜。試驗(yàn)結(jié)果表明形態(tài)學(xué)標(biāo)記對(duì)60份材料實(shí)現(xiàn)初步分類，SSR分子標(biāo)記則能夠有效地區(qū)別60份材料，并且為建立甜瓜品種的核酸指紋圖譜庫(kù)提供了理論數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)甜瓜品種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定。

甜瓜；形態(tài)學(xué)標(biāo)記；SSR標(biāo)記；聚類分析；指紋圖譜

自1981年以來(lái)，中國(guó)甜瓜產(chǎn)量一直穩(wěn)居世界第一，在世界總產(chǎn)量中占據(jù)半壁江山。正是由于我國(guó)是甜瓜生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國(guó)，近年來(lái)中國(guó)甜瓜的市場(chǎng)潛力快速開(kāi)發(fā)，每年都有大量的甜瓜新品種涌入市場(chǎng)。隨著新育成品種的不斷增加，骨干親本的重復(fù)使用，新基因資源的缺乏，新育成品種的鑒定難度逐漸增大；加之當(dāng)前中國(guó)甜瓜種子市場(chǎng)尚不夠規(guī)范，一些單位受商業(yè)利益驅(qū)動(dòng)掩蓋或篡改品種名稱，導(dǎo)致甜瓜市場(chǎng)材料普遍存在著由于同名異物或同物異名現(xiàn)象導(dǎo)致的品種真實(shí)性問(wèn)題（王美榮 等，2010）。為解決甜瓜種子經(jīng)營(yíng)中的糾紛與市場(chǎng)混亂問(wèn)題，有必要建立中國(guó)甜瓜品種的核酸指紋庫(kù)，為甜瓜品種純度與真實(shí)性的鑒定提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，保護(hù)瓜農(nóng)和育種家們的利益。

由于甜瓜本身類型非常豐富，且雜交種表型性狀易受環(huán)境影響，因此品種鑒定分類不能只靠田間性狀。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為品種鑒定提供了新的途徑（Naito et al.，2008）。前人已將分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于葫蘆科瓜類作物，Staub等（2004）利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)希臘甜瓜進(jìn)行了多樣性研究；劉萬(wàn)勃等（2002）利用 RAPD 和 ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì) 37 份甜瓜種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性研究；徐志紅等（2008）利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)31份甜瓜材料遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了研究；Szabó等（2005）利用SSR 技術(shù)對(duì) 47 份中世紀(jì)甜瓜種質(zhì)進(jìn)行了分析；艾呈祥等（2006）在比較分析各試材圖譜的基礎(chǔ)上，探討了品種指紋圖譜的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，并對(duì)構(gòu)建的2個(gè)甜瓜雜交種的指紋圖譜進(jìn)行了可信度分析，建立了適于種子檢驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)SSR標(biāo)記指紋圖譜。宋海斌（2012）利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)471份甜瓜材料進(jìn)行真實(shí)性鑒定，構(gòu)建SSR指紋代碼，發(fā)現(xiàn)其中52份材料的指紋代碼不具有唯一性。本試驗(yàn)利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記對(duì)60份甜瓜材料的12個(gè)表觀性狀進(jìn)行調(diào)查記錄，初步分類，同時(shí)利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜，以期為中國(guó)甜瓜指紋圖譜庫(kù)的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2012年3月至2013年10月進(jìn)行。其中田間試驗(yàn)在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)實(shí)習(xí)基地24號(hào)大棚進(jìn)行。將60份甜瓜材料每份取20粒飽滿種子，經(jīng)過(guò)8 h浸種，于28 ℃培養(yǎng)箱催芽，待80%種子出芽時(shí)播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，幼苗2～3片真葉時(shí)定植。在整枝時(shí)每株摘取幼嫩葉片混勻，放入液氮中速凍，然后置于-80 ℃冰箱中保存。待果實(shí)成熟時(shí)調(diào)查12個(gè)生物學(xué)性狀。分子試驗(yàn)在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院西甜瓜分子遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，主要包括材料DNA提取、SSR-PCR擴(kuò)增等。

1.2 試驗(yàn)材料

以60份中國(guó)市場(chǎng)上廣泛種植的甜瓜品種為試材，包括46份薄皮甜瓜，14份厚皮甜瓜（表1）。供試材料分別來(lái)自北京（9份）、甘肅（3份）、河南（2份）、黑龍江（10份）、吉林（23份）、遼寧（2份）、內(nèi)蒙古（1份）、新疆（10份）。

表1 供試甜瓜材料

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)標(biāo)記 在果實(shí)成熟期，每份材料隨機(jī)調(diào)查10個(gè)果實(shí)的形態(tài)學(xué)性狀，記載方法和標(biāo)準(zhǔn)參照《甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》（馬雙武和劉君璞，2006），并根據(jù)田間實(shí)際情況制定賦值標(biāo)準(zhǔn)。調(diào)查的12個(gè)性狀為：全生育期、單果質(zhì)量、果實(shí)硬度、可溶性固形物含量、芳香氣、網(wǎng)紋、裂紋、肉質(zhì)、果形指數(shù)、果皮底色、果肉顏色、瓤色。

質(zhì)量性狀的賦值，表現(xiàn)有無(wú)的質(zhì)量性狀，有記為 “1”，無(wú)記為“ 0”；表現(xiàn)多個(gè)類型的質(zhì)量性狀，可通過(guò)分級(jí)、數(shù)個(gè)數(shù)的方法統(tǒng)計(jì)。數(shù)量性狀分析，數(shù)量性狀的分級(jí)數(shù)據(jù)采用 10 級(jí)模式，即對(duì)數(shù)量性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行 10 級(jí)分類，1 級(jí)＜X-2δ，10 級(jí)＞X+2δ，中間每級(jí)間隔 0.5δ，X 為均值，δ為標(biāo)準(zhǔn)差。利用NTSYS-pc 2.10e軟件進(jìn)行相似系數(shù)計(jì)算和基于UPGMA算法的聚類分析，并通過(guò)TreePlot模板生成聚類圖。

1.3.2 SSR標(biāo)記 采用改良CTAB法提取DNA（Luan et al.，2008），濃度稀釋為30 ng·μL-1，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?8對(duì)SSR核心引物序列來(lái)自同一課題組宋海斌（2012）的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參考朱子成等（2011）的方法。每個(gè)樣品取3 μL，用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 W恒功率電泳約60 min，最終銀染顯色分析。

選擇重復(fù)性好、譜帶清晰的數(shù)據(jù)記錄結(jié)果。在相同遷移位置上有條帶記為“ 1”，無(wú)條帶記為“ 0”。依據(jù)公式（其中fi為i位點(diǎn)基因頻率）計(jì)算出各個(gè)引物的等位位點(diǎn)數(shù)及頻率，然后利用Picalc 0.6軟件計(jì)算各引物的多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）。利用NTSYS-pc 2.10e軟件進(jìn)行相似系數(shù)計(jì)算和基于UPGMA算法的聚類分析，并通過(guò)TreePlot模板生成聚類圖。

1.4 指紋圖譜構(gòu)建

1.4.1 指紋圖譜代碼 參考宋海斌等（2012）的方法構(gòu)建SSR指紋圖譜代碼。每對(duì)SSR引物可以擴(kuò)增出不同的多態(tài)性條帶，依據(jù)分子量從大到小的順序記錄各個(gè)條帶的分子量（單位為bp，在這里略去單位bp，只記錄數(shù)字），再將引物按照固定的順序進(jìn)行編號(hào)，依次為A、B、C……記錄每份材料經(jīng)不同的SSR引物擴(kuò)增出現(xiàn)的條帶，如果1份材料經(jīng)同一引物擴(kuò)增同時(shí)出現(xiàn)多條條帶，則用“-”連接數(shù)字，這樣每個(gè)品種的DNA經(jīng)不同的引物擴(kuò)增后將會(huì)形成由字母和阿拉伯?dāng)?shù)字組成的一系列帶型編號(hào)，便形成了該品種的SSR指紋圖譜代碼。如某品種的SSR指紋圖譜代碼為A215B400-305C0，則表示該品種經(jīng)A引物擴(kuò)增出現(xiàn)了分子量為215 bp的條帶，經(jīng)B引物擴(kuò)增出現(xiàn)了分子量為400 bp和305 bp的2條條帶，經(jīng)C引物沒(méi)有擴(kuò)增出條帶。

1.4.2 指紋圖譜QR編碼 應(yīng)用仙居朝歌軟件有限公司出品的QRCode轉(zhuǎn)化工具QR精靈2.12進(jìn)行編碼，將各品種的名稱、類型、SSR指紋圖譜代碼等一起錄入該軟件，形成指紋圖譜QR編碼。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)標(biāo)記結(jié)果

圖1 形態(tài)學(xué)標(biāo)記聚類分析圖

根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)記獲得60份材料的聚類分析圖（圖1），相似系數(shù)為0.73～0.94，在相似系數(shù)為 0.74處分為2組：第1組包括13份厚皮甜瓜，第2組包括46份薄皮甜瓜和1份厚皮甜瓜。在相似系數(shù)為0.77處，薄皮甜瓜又分為4組：第1組為華農(nóng)黃皮面瓜、彩衣仙子，這2份材料都具有極強(qiáng)的芳香氣，果皮底色都為黃色，表面有綠色的覆紋；第2組是來(lái)自甘肅的92-1，單果質(zhì)量較一般薄皮甜瓜的要大；第3組是來(lái)自黑龍江的彩虹9號(hào)，較一般薄皮甜瓜的全生育期要長(zhǎng)，在薄皮甜瓜里算晚熟品種；第4組為42份薄皮甜瓜和1份厚皮甜瓜，共43份，其中薄皮甜瓜均早熟，適應(yīng)性廣，可在我國(guó)各地露地種植，而1份厚皮甜瓜是來(lái)自甘肅的鐵旦子，早熟。以上形態(tài)學(xué)標(biāo)記聚類分析的結(jié)果，首先是基本按照傳統(tǒng)的分類方法分為薄皮、厚皮2種，又把薄皮中的供試材料按照單果質(zhì)量、晚熟、果皮底色、芳香氣分類，基本符合目前我國(guó)栽培甜瓜的分類，對(duì)引種栽培具有指導(dǎo)意義。但由于形態(tài)標(biāo)記數(shù)量有限、試驗(yàn)?zāi)晗薅痰仍驔](méi)有體現(xiàn)出厚皮甜瓜品種之間的差異，如果增加標(biāo)記數(shù)量、安排多年多點(diǎn)試驗(yàn)將更有助于指導(dǎo)甜瓜資源在育種中的利用。

2.2 SSR標(biāo)記結(jié)果

2.2.1 SSR多態(tài)性分析 將18對(duì)引物（表2）用于60份甜瓜材料的多樣性分析，共得到1 229條清晰可辨條帶，其中多態(tài)性條帶 147 條，多態(tài)性百分率為 12.0%，擴(kuò)增的 DNA 片段主要集中在 100～515 bp之間，每對(duì)引物可以檢測(cè)到4～11條數(shù)目不等的多態(tài)性條帶，平均為8條。多態(tài)性信息含量（PIC）平均為0.71，變化范圍為0.58～0.88。以上18對(duì)引物分布于一張整合的遺傳連鎖圖譜（ICUGI，2011 http://www.icugi.org/.）中的9個(gè)連鎖群（共12個(gè)連鎖群）。

表2 18對(duì)SSR核心引物信息

2.2.2 聚類分析 根據(jù)18對(duì)SSR引物的147個(gè)位點(diǎn)，構(gòu)建了60份供試材料聚類分析圖（圖2），遺傳相似系數(shù)的變化范圍在0.75～0.95之間。當(dāng)相似系數(shù)在 0.77 時(shí)，可以將所有供試材料分為6類，第1類是來(lái)自甘肅的薄皮甜瓜材料92-1；第2類是來(lái)自北京的厚皮甜瓜雜交種順甜紅帥；第3類是來(lái)自黑龍江的薄皮甜瓜彩虹9號(hào)；第4類是2份厚皮甜瓜材料，來(lái)自甘肅的鐵旦子、黃河蜜2號(hào)；第5類11份材料都為厚皮甜瓜，其中棚甜301來(lái)自北京，其余10份材料來(lái)自新疆，分別為2006QT-13、2006QT-14、2006QT-15、2006QT-18、2006QT-20、伽師瓜、86-1、雜交皇后、天域1號(hào)、2006QT-23；第6類包含了剩下的44份材料，都為薄皮甜瓜。

圖2 SSR標(biāo)記聚類分析圖

以上SSR標(biāo)記的聚類分析結(jié)果結(jié)合田間性狀調(diào)查分析，可將14份厚皮甜瓜分為3類：第1類的順甜紅帥與其他品種比較，明顯的區(qū)別就是果肉顏色為橘紅色，近似紅色，可能血緣與其他甜瓜材料相差較遠(yuǎn)；第2類是來(lái)自甘肅的厚皮甜瓜鐵旦子和黃河蜜2號(hào)，它們有直系的親緣關(guān)系，在進(jìn)化樹(shù)上距離也最近；第3類為剩余的11份厚皮甜瓜，其中10份來(lái)自同一地區(qū)新疆，而另一份材料棚甜301為厚皮雜交種，可能是與新疆地區(qū)某些材料有血緣關(guān)系。46份薄皮甜瓜的SSR標(biāo)記聚類分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)聚類結(jié)果基本一致。通過(guò)上述結(jié)果可以看出，供試材料很明顯地劃分為薄皮甜瓜和厚皮甜瓜兩大傳統(tǒng)分類，并且其中許多親緣關(guān)系較近的材料也都聚類在一起，如來(lái)源于甘肅的鐵旦子和黃河蜜2號(hào)聚在了一起，來(lái)源于新疆、親緣關(guān)系近的10份材料也都聚在一起。結(jié)果表明，SSR聚類結(jié)果能較好地反映供試材料的親緣關(guān)系。

2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

2.3.1 指紋圖譜代碼 60份供試材料分別經(jīng)過(guò)18對(duì)SSR引物擴(kuò)增后，依據(jù)本試驗(yàn)之前所設(shè)計(jì)好的指紋代碼構(gòu)建方法，為每份材料都建立了唯一的能夠區(qū)別于其他供試材料的SSR指紋圖譜代碼（表3）。

表3 供試甜瓜材料及其SSR指紋圖譜代碼

在SSR分子標(biāo)記中，每份材料由1對(duì)引物擴(kuò)增出0～3條條帶，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，所有供試材料由18對(duì)引物擴(kuò)增后，出現(xiàn)條帶最多的有4個(gè)品種：聯(lián)華香雪、金玉1號(hào)、黃河蜜2號(hào)、92-1，都含有26條條帶；出現(xiàn)條帶最少的是豐甜4號(hào)，共含有16條條帶，每份供試材料由18對(duì)引物擴(kuò)增出16～26條數(shù)目不等的條帶，平均為20.48條。

2.3.2 指紋圖譜QR編碼 利用QRCode轉(zhuǎn)化工具QR精靈2.12對(duì)所有供試材料進(jìn)行編碼，為每份材料均構(gòu)建了1份指紋圖譜QR編碼（圖3），其中包含了品種名稱、類型、來(lái)源地、SSR標(biāo)記的指紋代碼等信息。如圖3-A中包含以下信息：名稱，金香蜜；類型，薄皮雜交種；來(lái)源地，北京；SSR指紋圖譜代碼，A350-215B440C140D250-215E265F380-350G420H245I240J220-195K250-200L340-300M295N245O220P190Q190R115。

圖3 部分甜瓜品種指紋圖譜QR編碼

3 結(jié)論與討論

從以上試驗(yàn)結(jié)果可以看出，形態(tài)標(biāo)記與SSR標(biāo)記聚類結(jié)果大部分是一致的。兩者都按照薄皮甜瓜、厚皮甜瓜傳統(tǒng)方法對(duì)60份甜瓜材料進(jìn)行分類。在形態(tài)學(xué)分類中，薄皮甜瓜根據(jù)單果質(zhì)量、熟性、果皮底色、芳香氣分類；厚皮甜瓜基本聚在一起，只有1份材料可能由于早熟被分開(kāi)。SSR標(biāo)記則將厚皮甜瓜區(qū)分開(kāi)，且明顯具有原產(chǎn)地相同的材料相似系數(shù)高，聚類分析首先被聚在一起的趨勢(shì)；薄皮甜瓜除了其中2份材料分別聚為一類，與形態(tài)學(xué)標(biāo)記一致，剩余的大部分薄皮甜瓜聚為一類。

形態(tài)學(xué)標(biāo)記與SSR標(biāo)記在育種過(guò)程運(yùn)用時(shí)各有長(zhǎng)處，兩者結(jié)合使用更有利于種質(zhì)資源研究的深入，進(jìn)而鑒定種子的真實(shí)性，辨別是否存在同物異名、同名異物現(xiàn)象。形態(tài)學(xué)標(biāo)記簡(jiǎn)便易行，對(duì)大多數(shù)栽培品種的分類結(jié)果與品種的生態(tài)適應(yīng)性一致（金基石，2001）。SSR標(biāo)記用于檢測(cè)差異性不大的雜交類型的甜瓜種質(zhì)之間的分類非常有效，通過(guò)繪制 DNA 指紋圖譜可以非常準(zhǔn)確地鑒定種質(zhì)之間的差異，并可以快速地進(jìn)行品種鑒定。

本試驗(yàn)利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行了初步分類，但形態(tài)學(xué)標(biāo)記易受環(huán)境影響，如果只是一年試驗(yàn)，則數(shù)據(jù)可能會(huì)有誤差，故應(yīng)增加多年、多點(diǎn)試驗(yàn)，效果會(huì)更好。SSR分子標(biāo)記構(gòu)建的甜瓜指紋圖譜代碼，如同人的指紋，都是獨(dú)一無(wú)二的。但這份指紋圖譜代碼僅僅是DNA分子標(biāo)記數(shù)據(jù)的數(shù)字化，包含的信息量有限，檢測(cè)時(shí)效率不高。另一種指紋圖譜QR編碼，包含的信息量大，包含名稱、類型、來(lái)源地及指紋代碼，檢測(cè)非常方便，只要QR編碼掃描工具掃描就可解碼，得到這個(gè)品種錄入的信息，非常簡(jiǎn)便地獲取品種的“指紋”。這些優(yōu)點(diǎn)為甜瓜品種的鑒定提供了有利條件。另外，QR編碼可以容納的信息量非常大，為了更準(zhǔn)確地進(jìn)行品種鑒定，還可以加入一些經(jīng)過(guò)多年多點(diǎn)試驗(yàn)的、比較準(zhǔn)確的表觀性狀，如果皮底色、果肉顏色、糖度、單果質(zhì)量等。這樣的信息包含表型性狀信息和分子數(shù)據(jù)，將使甜瓜品種鑒定更加全面。

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Studies on Classification and Identification based on Morphological Markers and SSR Markers for Elite Varieties of Cucumis melo L.

LI Rui-feng，GAO Peng，ZHU Zi-cheng，LUAN Fei-shi*

（College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

Studies on classification and identification of 60 melon（Cucumis melo L.）materials were conducted by SSR marker and Morphological marker. Based on morphological cluster analysis the genetic similarity coefficient of the 60 materials ranged from 0.73-0.94，and at the genetic similarity coefficient of 0.74 these melons could be classified into 2 categories：Cucumis melo ssp. conomon and C. melo ssp. melo. Cucumis melo ssp. conomon could be subdivided into 4 groups，which are preliminarily classified by single fruit weight，peel color，aroma，maturity. The result of SSR cluster analysis showed that the genetic similarity coefficient of the 60 accessions ranged from 0.75-0.95. Also，the test materials could be divided into 6 categories at the genetic similarity coefficient of 0.77. 18 pairs of the SSR primers could detect 4-11 polymorphic bands with an average of 8 bands. The average polymorphism information content（PIC）was 0.71 with the changing range of 0.58-0.88. The fingerprinting effectively distinguished the 60 materials and every accession had unique fingerprinting using QR code.

Melon（Cucumis melo L.）；Morphological marker；SSR marker；Clustering analysis；Fingerprinting

李瑞峰，女，碩士研究生，專業(yè)方向：甜瓜分子育種，E-mail：lrf0208@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：欒非時(shí)，女，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：西甜瓜分子遺傳育種，E-mail：luanfeishi@sina.com

2014-01-06；接受日期：2014-03-14

國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系—分子育種崗位項(xiàng)目（CARS-26-02）