GC法測定與右旋糖酐40聯(lián)合用藥時血漿中甘露醇的含量

金 青，王愛霞，李 冉，譚然然

（青島科技大學化工學院，山東青島266042）

GC法測定與右旋糖酐40聯(lián)合用藥時血漿中甘露醇的含量

金 青，王愛霞，李 冉，譚然然

（青島科技大學化工學院，山東青島266042）

目的采用氣相色譜法研究聯(lián)合用藥時血漿中甘露醇的含量及右旋糖酐40對甘露醇的含量的影響。方法血漿樣品經(jīng)沉淀蛋白、衍生化處理后，考察血漿中加入甘露醇、右旋糖酐40及兩者聯(lián)合用藥后溶質峰的保留時間。結果血漿中右旋糖酐40對甘露醇的測定無影響。結論該方法可用于甘露醇和右旋糖酐40聯(lián)合用藥時血漿中甘露醇含量的測定。

氣相色譜法；右旋糖酐40；甘露醇

甘露醇是臨床常用的脫水劑和利尿劑，其注射液作為高滲降壓藥，是臨床搶救特別是腦部疾患搶救常用的一種藥［1］，具有降低顱內壓藥物所要求的降壓快、療效準確的特點，是目前控制腦水腫的首選脫水劑。小分子及低分子右旋糖酐可提高血漿膠體滲透壓、擴充血容量、降低血液黏滯度、并使凝血因子相應稀釋［2］。在臨床上，甘露醇常與右旋糖酐40及丹參聯(lián)合應用治療心腦血管疾病，如腦梗死［3］。其在治療組織損傷所導致的肢體腫脹方面，能有效地促進損傷愈合。由于右旋糖酐40的主要作用是作為血漿代用品進行血液擴容稀釋，在體內起主要作用的藥物是甘露醇，因此本實驗建立了用GC法測定與右旋糖酐40聯(lián)合用藥時血漿中甘露醇的含量，并對右旋糖酐40是否對測定結果有影響做了探討［4，5］。

1 實驗部分

1.1 實驗條件

1.1.1 儀器與試劑 GC－920氣相色譜儀，上海海欣色譜儀器有限公司；FA1004N電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司；MBE數(shù)顯鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；小型離心機；可調微量移液器，上海宙輝生化儀器有限公司；RXZ－128智能型人工氣候箱，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司。

甘露醇（藥用，青島翔宇海藻有限公司）；右旋糖酐40（藥用，山東金陽藥業(yè)有限公司）；木糖醇（天津市博迪化工有限公司）；肝素（效價150 IU· mg－1，中國惠興生化試劑有限公司）；吡啶（天津市博迪化工有限公司）；乙酸酐（廣州齊昌化工有限公司）；磺基水楊酸（分析純，上海惠錦化工有限公司）。

1.1.2 色譜條件 SGE－AC－10毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，0.25μm）；載氣為氮氣（流速約20 mL·min－1），氫氣（流速約15 mL·min－1），空氣（流速約250 mL·min－1）；程序升溫為：起始溫度200℃保持1 min，以速率4℃·min－1升至240℃，保持20 min；進樣量為1μL。

1.2 血漿中甘露醇含量測定的方法學建立

1.2.1 對照品及標準品溶液的制備 精密稱取甘露醇對照品與木糖醇各0.500 0 g于50mL量瓶中，加蒸餾水溶解，稀釋至刻度，配制成濃度為10 mg·mL－1的標準溶液。

1.2.2 樣品試樣制備 取家兔血漿1 mL，立即置于涂有肝素的尖底塑料離心管中，振蕩使混合均勻。于3 500 rpm的轉速下離心10min，用可調微量移液器吸取上層清液，即為血漿。取0.1 mL添加了適量甘露醇對照品溶液的血漿，加入內標物木糖醇對照液0.01 mL以及70 g·L－1的磺基水楊酸溶液0.1 mL漩渦混勻后，6 000 rpm離心10 min，除去蛋白，將上層清液全部取出，空氣吹干后加入體積比為1∶1的吡啶、乙酸酐試劑100μL衍生化之后，振蕩使之充分混合，于80℃下反應40 min，0.45μm微孔濾膜濾過后供進樣用。

1.2.3 特異性實驗 在上述色譜條件下，對空白溶劑、空白血漿、空白血漿加甘露醇對照品和靜注甘露醇注射液后的血漿樣品經(jīng)試樣制備方法處理后進樣分析得到色譜圖（見圖1）。

1.2.4 標準曲線和定量范圍 取1.5 mL尖底塑料離心管數(shù)個，加入0.5 mL空白血漿，再加入適量不同濃度的甘露醇標準系列溶液，使血漿藥物濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mg·mL－1，加入內標后混勻，經(jīng)樣品試樣制備項下方法處理后進樣分析。以濃度（C）對甘露醇與內標峰面積的比值（F）進行線性回歸（權重因子K／F，K＝1.002 1）。

1.2.5 精密度實驗 按“1.2.4”項下操作。制備甘露醇0.10、1.00和10.00 mg·mL－1三個濃度的質控樣品，每濃度5樣本，樣本經(jīng)衍生化之后進樣，連續(xù)測定3 d。根據(jù)當日的工作曲線，計算QC樣品的測得濃度，根據(jù)QC樣品結果計算本法的精密度。

1.2.6 穩(wěn)定性考察 取“1.2.5”項下0.10、1.00和10.00mg·mL－1QC樣品各6份，分別在室溫放置6 h及－20℃條件下放置，考察室溫放置試驗、凍融試驗及60 d長期凍融試驗的穩(wěn)定性。

1.2.7 萃取回收率 取空白血漿數(shù)份，加入適量的甘露醇標準溶液混勻，使血漿中甘露醇的濃度分別為0.10、1.00和10.00 mg·mL－1。每個濃度5樣本進樣量1μL。計算測得的甘露醇濃度與加入甘露醇的質量濃度之比考察萃取回收率。

1.3 右旋糖酐40對該法測定甘露醇含量的影響

取空白血漿加右旋糖酐40，空白血漿加甘露醇及右旋糖酐40，靜注甘露醇注射液后的血漿樣品經(jīng)處理后進樣分析得到的色譜圖（結果見圖2）。通過對進樣后的色譜圖樣品峰的保留時間進行比較，判定右旋糖酐40對甘露醇含量測定的影響。

2 結果與討論

2.1 樣品的前處理方案的選擇 由于血藥濃度一般較低，生物樣品中的內源性物質及代謝產(chǎn)物較為復雜，往往會干擾樣品測定。因此樣品需經(jīng)過分離、純化和濃集等處理后再供測定。蛋白沉淀法具有簡單和重復性好的優(yōu)點，雖有帶入分析的雜質較多、會稀釋樣品的進樣濃度等缺點，但在處理方案中將樣品在氮氣流下吹干濃縮，可以提高分析方法的靈敏度。而后進行的衍生化反應是基于特殊的基團進行的，因而可以排除雜質干擾，提高靈敏度，更適合于本研究。因此，此方法提取穩(wěn)定且合理，是一種較優(yōu)的前處理方案。

2.2 衍生化方法的確定 根據(jù)參考文獻［6］選用吡啶、雙－三甲基硅烷乙酰胺、三甲基氯硅烷（2∶1∶1，V／V／V）作為硅烷衍生化的溶劑，經(jīng)過在60℃下衍生化30 min后，氣相檢測效果不佳，峰面積大小不穩(wěn)定。因而改用吡啶、乙酸酐（1∶1，V／V）進行酯化處理［7］，出峰清晰，峰面積穩(wěn)定。改變衍生化溫度分別為60、70、80、90和100℃，固定衍生化的加熱時間為20 min，取10mg·mL－1甘露醇標準溶液100 μL進行實驗。實驗結果表明，在60℃時，甘露醇與衍生化試劑不反應，隨著加熱溫度逐漸升高，反應速度加快，衍生化產(chǎn)物的峰面積也隨之增加，但溫度過高時會影響產(chǎn)率，并且影響血漿樣品的穩(wěn)定性。故選擇衍生化溫度為80℃。然后固定衍生化溫度為80℃，改變加熱時間為10～60 min進行實驗，當加熱時間為30～60 min時，甘露醇的峰面積最大并保持穩(wěn)定，所以選擇加熱時間為40 min。

2.3 甘露醇的含量測定方法學驗證結果 本實驗從專屬性、線性范圍和最低檢出質量濃度、精密度、回收率、穩(wěn)定性等方面對該法進行了方法學驗證。甘露醇的保留時間約為13.0 min，內標的保留時間約為9.5 min，甘露醇峰與雜質峰可完全分離，血漿中雜質峰不干擾甘露醇的測定，本法具有較高的專屬性（見圖1）；回歸方程為C＝0.995 0F－0.005 6（r2＝0.999 9，n＝5），線性范圍0.05～10.0 mg·mL－1，甘露醇最低可檢出質量濃度為0.02 mg·mL－1（以信噪比大于3計）；回收率平均值為99.03%，且RSD均小于3%，測得結果具有較高的重現(xiàn)性（見表1）；日內和日間RSD均小于15.0%，精密度良好；室溫放置試驗、凍融試驗和長期穩(wěn)定性試驗測定值和添加值的相對誤差（R.E.%）均小于15%，說明分析測試過程中樣品較為穩(wěn)定。

圖1 色譜圖

圖2 色譜圖

表1 萃取回收率（%）

續(xù)表1：

2.4 右旋糖酐40對該法測定甘露醇含量的影響實驗結果 由色譜圖可知，血漿中的右旋糖酐沒有出峰，加入右旋糖酐40前后甘露醇的保留時間相同。表明血漿中的右旋糖酐40并不影響甘露醇的含量測定結果。

3 結論

本實驗方法經(jīng)驗證符合生物樣品分析要求，且右旋糖酐40不影響甘露醇的測定結果。該方法可用于甘露醇和右旋糖酐40聯(lián)合用藥時血漿中甘露醇的含量測定。

［1］王堯，范佳，剛曉坤，等.腦出血治療中甘露醇使用的臨床體會［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2010，10：946－947.

［2］蘇華燕，戚永娟，梁開.低分子右旋糖酐治療腎病綜合征療效的分析［J］.中國校醫(yī)，2007，21（4）：F0003.

［3］陳淑玲.復方丹參低分子右旋糖酐甘露醇聯(lián)用治療腦梗塞60例［J］.河北醫(yī)學，2007，13（2）：234－236.

［4］王和興，黎源倩，李磊.保健食品中甘露醇的毛細管氣相色譜分析［J］.四川大學學報（醫(yī)學版），2006，37（3）：480－483.

［5］王佩，吳錫銘.衍生化毛細管氣相色譜法測定人尿液中甘露醇和乳果糖［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志.2001，18（5）：391－393.

［6］Laker MF，Mount JN.Mannitol Estimation in Biological Fluids by Gas－Liquid Chromatography of Trimethylsilyl Derivatives［J］.Clin Chem，1980，26（3）：441－443.

［7］李冉，金青，唐延甜.低分子右旋糖酐對甘露醇注射液在家兔體內藥動學的影響［J］.西北藥學雜志，2012，27（3）：248－251.

Determ ination of themannitol in plasma by GC when combined w ith Dextran 40

JIN Qing，WANG Ai-xia，LIRan，TAN Ran-ran
（College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao 266042，China）

ObjectiveTo study the effect of Dextran 40 on the molcular in plasma by GC when they were combined.MethodsAfter the plasma sample was precipitated protein and derivatized，comparative the retention time of the Mannitol，Dextran 40 and the combination.ResultsThe chromatograms show that Dextran 40 had no effect on the determination of mannitol.ConclusionThis method can be used for the determination of mannitol in plasma when combination with Dextran 40.

GC；Dextran 40；Mannitol

R927.2

A

2095－5375（2014）02－0090－004

金青，女，副教授，碩士生導師，藥物新劑型的研究，E－mail：jinqing_mail＠qust.edu.cn