半乳糖苷三氮唑鷹嘴豆芽素A的合成與抗缺氧活性研究

景臨林，范小飛，馬慧萍，樊鵬程，賈正平

鷹嘴豆芽素A(4'-甲氧基-5，7-二羥基異黃酮)是一種可食用異黃酮，主要存在與紅三葉草和眾多豆類植物中。鷹嘴豆芽素A的分子結(jié)構(gòu)與動物雌性激素相似，是一種重要的植物雌激素［1］。研究表明鷹嘴豆芽素 A 具有抗菌［2］、抗炎［3］、抗腫瘤［4］、抗骨質(zhì)疏松［5］、降血脂［6］、抑制黑色素生成［7］和神經(jīng)保護(hù)［8］等眾多生物活性，但溶解性差，在體內(nèi)代謝和清除速率快，生物利用度很低。為了提高鷹嘴豆芽素A的藥理活性、增加其代謝穩(wěn)定性和生物利用度，本研究以D-半乳糖、炔丙基溴和鷹嘴豆芽素A為原料，將具有生物活性的糖苷與鷹嘴豆芽素A分子通過1，4-二取代的 1，2，3-三氮唑連接，合成了一種衍生物——半乳糖苷三氮唑鷹嘴豆芽素A，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR、IR、EI-MS和元素分析確認(rèn)，本研究重點(diǎn)觀察其抗缺氧活性。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 鷹嘴豆芽素A(含量＞98%)購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司;D-木糖購自Sigma公司;GF254高效板和柱層析硅膠購自青島海洋化工廠分廠;732強(qiáng)酸苯乙烯陽離子交換樹脂購自阿拉丁試劑公司;氰化鉀(上海徐航化工廠，批號:20011010);亞硝酸鈉(煙臺市雙雙化工有限公司，批號:20111126)，乙酰唑胺(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，批號:100114，純度＞99%);其他均為市售分析純試劑。無水的溶劑經(jīng)除水處理。

1.2 實(shí)驗動物 清潔級BABL/C小鼠90只，體重18～22 g，雌雄各半，由蘭州生物制品研究所實(shí)驗動物中心提供，合格證號:14-002，飼養(yǎng)于蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實(shí)驗科。

1.3 實(shí)驗儀器 X-4B顯微熔點(diǎn)儀(上海精密儀器儀表有限公司);NEXUS 670紅外光譜儀(KBr壓片，美國Nicolet公司);Vario EL cube型元素分析儀(德國Elementar公司);Brucker AVANCE III 400核磁共振波譜儀(瑞士Brucker公司，以CDCl3或DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));LCMS-API 3200質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 β-D-四乙酰半乳糖疊氮化物:β-D-四乙酰半乳糖疊氮化物按照文獻(xiàn)［9］方法制備，合成路線見圖1。

1.4.2 4'-甲氧基-5-羥基-7-炔丙氧基異黃酮(化合物1):將鷹嘴豆芽素 A 2．84 g(10 mmol)、K2CO33.36 g(20 mmol)加入單口瓶中，加入100 ml無水丙酮，劇烈攪拌下緩慢加入溴丙炔(2 ml)，回流反應(yīng)3 h。待畢(TLC監(jiān)測)，加入50 ml水，減壓除去丙酮，過濾，濾餅依次用水、1 mol/L HCl溶液和水洗滌，空氣中干燥后得淺黃色固體，為目標(biāo)化合物1，產(chǎn)率95%。

1.4.3 4'-甲氧基-7-(1-((2'，3'，4'，6'-四乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-1，2，3-三氮唑-4-基)甲氧基)-5-羥基異黃酮(化合物2):將β-D-四乙酰半乳糖疊氮化物 4．48 g(12 mmol)、化合物 1 2．93 g(10 mmol)懸浮于100 ml叔丁醇∶水(1∶1)的混合溶劑中，攪拌下依次加入0．2 mmol抗壞血酸鈉和0．1 mmol CuSO4·5H2O，55℃劇烈攪拌反應(yīng)6 h，停止反應(yīng)，待體系降至室溫時，向反應(yīng)體系中加入100 ml CH2Cl2和20 ml 2 mol/L HCl，分液，有機(jī)相用水洗滌兩次，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓除去溶劑后快速柱層析分離，得白色固體，為目標(biāo)化合物2，產(chǎn)率85%。

1.4.4 4'-甲氧基-7-(1-((2'，3'，4'，6'-四羥基-β-D-吡喃半乳糖基)-1，2，3-三氮唑-4-基)甲氧基)-5-羥基異黃酮(化合物3):將化合物2 0．70 g(10 mmol)置于一三口燒瓶中，加入50 ml甲醇，冰水浴冷卻至0℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢滴加甲醇鈉的甲醇溶液(1．2 ml，1．0 mol/L)。加畢，升至室溫繼續(xù)反應(yīng)3 ～4 h。待畢(TLC監(jiān)測)，用732強(qiáng)酸苯乙烯陽離子交換樹脂調(diào)節(jié)體系至中性，此時有白色不溶物析出，過濾，用甲醇洗滌濾餅數(shù)次，真空干燥后得目標(biāo)化合物3，產(chǎn)率94%。合成路線見圖2。

圖1 β-D-四乙酰半乳糖疊氮化物的合成路線

圖2 半乳糖苷三氮唑鷹嘴豆芽素A的合成路線

1.4.5 常壓密閉缺氧實(shí)驗:取清潔級BABL/C小鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分成對照組、乙酰唑胺組和化合物3組，每組10只。對照組注射等容積生理鹽水加適量Tween 80，乙酰唑胺組腹腔注射乙酰唑胺200 mg/kg，化合物3組分別腹腔注射化合物3 200 mg/kg。給藥30 min后，將小鼠放入250 ml廣口瓶中，每瓶放1只小鼠，加蓋密封(瓶內(nèi)放堿石灰15 g以吸收CO2和H2O，墊濾紙以吸收尿液，廣口瓶用前均盛水校正容量)，以小鼠呼吸停止為指征，記錄小鼠的存活時間。

1.4.6 氰化鉀中毒缺氧實(shí)驗:分組與給藥劑量同“1．4．5”。給藥20 min后，每只小鼠再靜脈注射氰化鉀10 mg/kg，記錄小鼠從氰化鉀注射完畢至停止呼吸的時間。

1.4.7 亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗:分組及給藥方法同“1．4．5”。給藥后 20 min，每只小鼠再腹腔注射亞硝酸鈉200 mg/kg，記錄小鼠從亞硝酸鈉注射完畢至停止呼吸的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實(shí)驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，α=0．05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)表征 化合物1:mp．152．1～154.7℃;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:12．88(1H，s，5 － OH)，7．89(1H，s)，7．46(2H，d，J=8．4 Hz)，6．99(2H，d，J=8．8Hz)，6．50(1H，d，J=2．0 Hz)，6．46(1H，d，J=2．0 Hz)，4．76(2H，d，J=2．0 Hz)，3．85(3H，s，－ OCH3)，2．59(1H，s);ESI-MS(m/z):323［M+H］+。IR(KBr):3443，2123，1755，1665，1614，1577，1516，1358，1303，1245，1216，1187，1051，817。Anal．calcd．for C19H14O5:C 70．80，H 4.38;found C 71．13，H 4．15。

化合 物 2:mp．170．5 ～ 172．9℃;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:12．88(1H，s，5-OH)，7．96(1H，s)，7．88(1H，s)，7．46(2H，d，J=8．8 Hz)，6.99(2H，d，J=8．8 Hz)，6．53(1H，d，J=2．0 Hz)，6．45(1H，d，J=2．0 Hz)，5．86(1H，d，J=9．6 Hz)，5．56(2H，t)，5．27(2H，s，-OCH2)，5．24(1H，d，J=3.2 Hz)，4．25-4．11(3H，m)，3．85(3H，s，－OCH3)，2．23，2．12，2．05，1．89(12H，4s，4 ×COCH3);ESI-MS(m/z):697［M+H］+。IR(KBr):3446，1754，1655，1613，1581，1516，1371，1247，1226，1180，1049，836。Anal．calcd．forC33H33N3O14:C 56．98，H 4．78，N 6．04;found C 57．10，H 4．79，N 6．01。

化合物3:mp．196．3 ～197．8℃;1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ:12．95(1H，s，5-OH)，8．48(1H，s)，8．45(1H，s)，7．53(2H，d，J=8．8 Hz)，7．01(2H，d，J=8．8 Hz)，6．86(1H，d，J=2．0 Hz)，6．55(1H，d，J=2．0 Hz)，5．32(1H，d，J=9．2 Hz)，5．30(2H，s，－ OCH2)，5．29(1H，d，J=6．0 Hz)，5．06(1H，d，J=5．6 Hz)，4．71(1H，t)，4．68(1H，d，J=5．2 Hz)，4．06(1H，m)，3．80(3H，s，－ OCH3)，3．73(1H，m)，3．57-3．47(3H，m);ESI-MS(m/z):528［M+H］+。IR(KBr):3433，1653，1614，1579，1514，1372，1293，1251，1189，1154，1050，834。Anal．calcd．for C25H25N3O10:C 56．92，H 4．78，N 7．97;found C 56．83，H 4．85，N 8．03。

2.2 常壓密閉缺氧實(shí)驗結(jié)果 對照組、乙酰唑胺組與化合物3組常壓密閉缺氧小鼠存活時間分別為(31．39 ± 1．56)、(36．87 ± 4．32)、(42．48 ±5．56)min。與對照組比較，乙酰唑胺組和化合物3組常壓密閉缺氧小鼠存活時間均明顯延長(P＜0.01)，化合物3組存活時間延長尤為顯著(P ＜0.01)。

2.3 化學(xué)物質(zhì)中毒缺氧實(shí)驗結(jié)果 與對照組比較，乙酰唑胺組和化合物3組氰化鉀、亞硝酸鈉中毒缺氧小鼠存活時間均明顯延長(P＜0.05，P＜0.01)，化合物3組存活時間延長尤為顯著(P＜0.05)，見表1。

表1 3組化學(xué)物質(zhì)中毒缺氧小鼠存活時間比較(x ± s，min)

3 討論

3.1 分子設(shè)計 1，2，3-三氮唑具有抗真菌、抗細(xì)菌、抗結(jié)核、抗癌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗驚厥等多種生物活性［10］。糖在生物體內(nèi)擔(dān)負(fù)著生命活動諸多重要的生物功能。將糖基連接到三唑類分子片段上可增強(qiáng)其親水性和導(dǎo)向性，改變藥代動力學(xué)性能，幫助膜輸送。近期研究表明，利用Cu催化的“Click”化學(xué)合成的糖基三氮唑化合物具有多種生物活性［11］，將其用于化合物的結(jié)構(gòu)修飾與改造，可研發(fā)出結(jié)構(gòu)新穎、活性優(yōu)異的新化合物。

3.2 合成方法 Cu(I)催化下用端基炔和疊氮化合物進(jìn)行的1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)，又稱“Click”化學(xué)，是快速、高效、高選擇性合成大量新化合物的可靠方法［12］。文獻(xiàn)報道的“Click”化學(xué)反應(yīng)條件不盡相同，通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，本研究選擇tBtOH∶H2O(1∶1，v/v)體系為反應(yīng)溶劑、CuSO4·5H2O/抗壞血酸鈉為催化劑、反應(yīng)溫度控制在55℃、反應(yīng)時間為6 h為其最佳的反應(yīng)條件。在去除糖苷的乙?；鶗r，采取堿性水解法，在甲醇鈉/甲醇體系中室溫攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂調(diào)節(jié)pH值，經(jīng)過簡單過濾即得目標(biāo)產(chǎn)物，避免了柱色譜分離，操作簡便，產(chǎn)率較高。

3.3 結(jié)構(gòu)表征 在化合物2和3的1H-NMR譜中，δ∶12．88和12．95為鷹嘴豆芽素A分子中5位羥基質(zhì)子信號，三氮唑結(jié)構(gòu)中質(zhì)子信號分別在δ∶7.88和8．45表現(xiàn)出的一個尖銳的單峰，δ∶5．27和5．30出現(xiàn)-CH2-的質(zhì)子信號，說明分子結(jié)構(gòu)中含有鷹嘴豆芽素A和三氮唑基團(tuán)。當(dāng)化合物2水解為化合物3時，2．00附近4個乙?；馁|(zhì)子信號消失?；衔?2和 3的紅外譜圖中，3446和3433 cm－1出現(xiàn)典型羥基吸收峰，1650 cm－1的單譜帶強(qiáng)峰為異黃酮結(jié)構(gòu)中羰基的吸收峰，1750 cm－1為乙?；恤驶奶卣魑辗??；衔?轉(zhuǎn)化為化合物3時，乙?；凰猓?750 cm－1附近吸收峰消失。

3.4 抗缺氧活性研究 常壓密閉缺氧為非特異性缺氧［13］，會造成小鼠心腦組織損傷，通過該模型對所合成的目標(biāo)化合物3進(jìn)行抗缺氧活性評價，結(jié)果表明，與對照組相比，化合物3能顯著延長常壓密閉小鼠的存活時間，且活性優(yōu)于乙酰唑胺。

氰化鉀中毒死亡模型為細(xì)胞內(nèi)缺氧模型［14］，氰化鉀可將氧化型細(xì)胞色素氧化酶轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸哞F細(xì)胞色素氧化酶，使之不能形成還原型細(xì)胞色素氧化酶，導(dǎo)致呼吸鏈中斷，引起細(xì)胞內(nèi)窒息;亞硝酸鈉中毒死亡模型為細(xì)胞外液缺氧模型［15］，亞硝酸鈉可將亞鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去與氧的結(jié)合能力，造成組織缺氧。本研究結(jié)果表明，化合物3能明顯延長細(xì)胞內(nèi)、外液缺氧小鼠的存活時間。

綜上所述，本研究以D-半乳糖、炔丙基溴和鷹嘴豆芽素A為原料，將鷹嘴豆芽素A與半乳糖通過1，2，3-三氮唑結(jié)構(gòu)相連，合成了一種新型半乳糖苷三氮唑鷹嘴豆芽素A衍生物，合成路線短、方法簡單、條件溫和、產(chǎn)率較高，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜分析與目標(biāo)化合物一致，抗缺氧活性實(shí)驗結(jié)果表明，該化合物具有明顯的抗缺氧作用。

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