質(zhì)譜成像技術(shù)在實(shí)體腫瘤研究中的應(yīng)用與展望

楊 琳，王 林，宋三泰，劉曉晴

近年來(lái)，質(zhì)譜成像技術(shù)取得了巨大進(jìn)步，一些研究組報(bào)道了質(zhì)譜成像技術(shù)在疾病特別是在腫瘤研究中的應(yīng)用［1-2］。質(zhì)譜成像技術(shù)被用于分析腦腫瘤、肺癌、乳腺癌等腫瘤的分子分布信息，獲取腫瘤特征性分子。此外，質(zhì)譜成像技術(shù)還被用于研究藥物及其代謝物等小分子在腫瘤中的空間分布特征。本文就質(zhì)譜成像技術(shù)在腦腫瘤、肺癌和乳腺癌研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 概述

質(zhì)譜成像是以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的成像方法，該方法通過(guò)質(zhì)譜直接掃描生物樣品成像，可以在同一張組織切片或組織芯片上同時(shí)分析數(shù)百種分子的空間分布特征［3-5］。質(zhì)譜成像技術(shù)原理為:在低溫環(huán)境下，將組織切片黏附于MALDI-MS靶板上，并在組織切片表面噴涂基質(zhì)，基質(zhì)與組織切片中的被分析物在原位形成共結(jié)晶。隨后，將靶板直接送入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)激光照射時(shí)，共結(jié)晶吸收能量而引起被分析物的離子化。質(zhì)譜儀對(duì)被定義的分析區(qū)域掃描并采集離子信息。每一個(gè)采集點(diǎn)上獲得的信息包括該點(diǎn)的坐標(biāo)、質(zhì)荷比以及離子強(qiáng)度的信息。這些信息通過(guò)專(zhuān)門(mén)的圖像分析軟件轉(zhuǎn)換處理后，即可獲得該區(qū)域各個(gè)組分的二維離子分布圖。組分在每個(gè)點(diǎn)上的相對(duì)量可用亮度強(qiáng)弱或不同顏色來(lái)表示［6-8］。該技術(shù)無(wú)需任何標(biāo)記，利用分子質(zhì)荷比區(qū)分不同的分子，尋找差異分子。從這些差異分子中發(fā)現(xiàn)的組織特異性標(biāo)志物可用來(lái)區(qū)分不同組織及同一組織內(nèi)的不同成分［5，9-11］。

2 質(zhì)譜成像技術(shù)在實(shí)體腫瘤研究中的應(yīng)用

2.1 腦腫瘤 2001年Stoeckli等［11］首次證實(shí)質(zhì)譜成像技術(shù)在腫瘤研究中的巨大潛能，該文論述了如何應(yīng)用質(zhì)譜成像技術(shù)揭示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織切片的化學(xué)空間結(jié)構(gòu)，該研究結(jié)果顯示，蛋白胸腺素β4常出現(xiàn)在腫瘤團(tuán)塊增殖最活躍的部分，而蛋白S100A4則出現(xiàn)在腫瘤團(tuán)塊的中心。隨后質(zhì)譜成像技術(shù)被證實(shí)可直接進(jìn)行組織分析定位神經(jīng)膠質(zhì)瘤，并進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度分級(jí)［12-13］。Chaurand 等［14］論述了如何應(yīng)用質(zhì)譜成像技術(shù)測(cè)定神經(jīng)膠質(zhì)瘤中鈣結(jié)合蛋白S100B含量水平區(qū)以分神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度。Schwartz等［12］對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織切片進(jìn)行質(zhì)譜成像分析，不但能夠區(qū)分腫瘤組織與正常組織，還能將IV型神經(jīng)膠質(zhì)瘤同II型、III型有效區(qū)分。在IV型中，S100B(m/z 10 836)蛋白呈明顯高表達(dá)，這與免疫組化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果完全一致。3D質(zhì)譜成像［15］及 3D 質(zhì)譜成像同步聯(lián)合 MRI［11，16］也被應(yīng)用于腦腫瘤的研究。有研究表明星形細(xì)胞磷蛋白Pea15在Ⅲ神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的水平升高［17］，MRI圖像與3D質(zhì)譜成像均能很好的顯示星形細(xì)胞磷蛋白Pea15在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的空間分布。Sinha等［16］的研究顯示，通過(guò)對(duì)比星形細(xì)胞磷蛋白Pea15 3D質(zhì)譜圖像的2D投影圖像與不同序列的MRI圖像(包括T1加權(quán)像、T2加權(quán)像、彌散像及脂肪抑制像)以及膠質(zhì)瘤與瘤旁正常組織的感興趣區(qū)域分析結(jié)果，可以看出3D質(zhì)譜成像區(qū)分膠質(zhì)瘤的能力同MRI一樣出色。MRI圖像可以顯示膠質(zhì)瘤與正常腦組織間的細(xì)胞密度、水及蛋白差異;質(zhì)譜成像技術(shù)則能詮釋MRI顯示的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)特征的分子表型，并且能評(píng)估這些分子表型的改變是否與腫瘤生長(zhǎng)的解剖學(xué)改變一致［7］。

質(zhì)譜成像同樣被應(yīng)用于在腦腫瘤組織中直接分析藥物及其代謝物等小分子的空間分布信息［18-19］。近年來(lái)，質(zhì)譜成像在小分子領(lǐng)域的應(yīng)用還被開(kāi)發(fā)用來(lái)檢測(cè)MRI增強(qiáng)劑的組織分布，并用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證［20］。靶向MRI增強(qiáng)劑是早期發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志物的關(guān)鍵工具之一，質(zhì)譜成像技術(shù)能獨(dú)立提供增強(qiáng)劑的空間分布信息，借此可明確與增強(qiáng)劑結(jié)合的靶向性標(biāo)志物的空間分布特征。

2.2 肺癌 Groseclose等［10］應(yīng)用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)包含112例針吸活檢標(biāo)本的小型肺癌組織芯片進(jìn)行了研究。首先，由一位病理學(xué)家在光鏡下對(duì)該組織芯片的HE染色切片進(jìn)行分析，劃分每一例活檢標(biāo)本的癌區(qū)、癌旁區(qū)和正常組織區(qū)。隨后，來(lái)自相同活檢標(biāo)本的未經(jīng)病理標(biāo)注組織芯片與病理標(biāo)注組織芯片的HE染色切片進(jìn)行匹配比對(duì)，劃定未經(jīng)病理標(biāo)注組織芯片的癌區(qū)、非癌區(qū)范圍，最后用未經(jīng)標(biāo)注的組織芯片進(jìn)行組織溶解質(zhì)譜成像。進(jìn)行質(zhì)譜成像的組織芯片上，一部分針吸活檢組織作為訓(xùn)練組，并用病理學(xué)家的診斷對(duì)訓(xùn)練組針吸活檢組織的質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行標(biāo)注，建立分類(lèi)模型。這個(gè)包含73個(gè)胰蛋白酶肽峰的基于支持矢量機(jī)的分類(lèi)模型對(duì)腺癌的識(shí)別準(zhǔn)確率為97.9%，對(duì)鱗癌的識(shí)別準(zhǔn)確率為98.6%。

張瑩等［21］采用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織和癌旁組織分別進(jìn)行正離子反射模式和線(xiàn)性模式質(zhì)譜掃描，發(fā)現(xiàn)癌組織在m/z 3000～3500范圍內(nèi)有特征簇峰出現(xiàn)。Marko Varga等［22］應(yīng)用質(zhì)譜成像成功區(qū)分慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)合并肺癌患者肺內(nèi)癌組織和非癌組織，并明確了異丙托銨在COPD合并肺癌患者肺內(nèi)的分布情況。Harris等［23］應(yīng)用質(zhì)譜成像技術(shù)明確了酰基輔酶A結(jié)合蛋白在原位及浸潤(rùn)性非小細(xì)胞肺癌組織中的分布，該研究顯示酰基輔酶A結(jié)合蛋白在原位及浸潤(rùn)性非小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)，高表達(dá)該蛋白的患者預(yù)后差。

近年來(lái)，質(zhì)譜成像還被應(yīng)用于肺癌治療藥物酪氨酸酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)——吉非替尼和厄羅替尼的研究。Marko Varga等［24］采用壓電配藥方法使TKI沉積在肺癌組織表面，并對(duì)分布于肺癌組織表面的TKI進(jìn)行質(zhì)譜成像，以期應(yīng)用肺鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌3種不同的非小細(xì)胞亞型建立新的TKI藥物代謝動(dòng)力學(xué)模型。研究發(fā)現(xiàn)，不論肺癌的病理類(lèi)型與藥物種類(lèi)為哪一類(lèi)，間質(zhì)區(qū)的藥物信號(hào)均較腫瘤區(qū)更強(qiáng)。Signor等［25］選用鼠為模型，口服厄羅替尼，劑量5 mg/kg，應(yīng)用質(zhì)譜成像研究厄羅替尼及其代謝物在肝臟、脾、肌肉組織中的分布，結(jié)果顯示厄羅替尼在肝中濃度最高，且在肝中發(fā)現(xiàn)了厄羅替尼的代謝物，表明厄羅替尼是在肝中進(jìn)行代謝的。

2.3 乳腺癌 雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)狀態(tài)與乳腺癌的診斷及治療密切相關(guān)。近年來(lái)，有研究表明，對(duì)上述3種蛋白mRNA的多重檢測(cè)能大幅提升乳腺癌的診斷水平，并指導(dǎo)乳腺癌的個(gè)體化治療［26］。Rauser等［27］證實(shí)質(zhì)譜成像能直接從患者乳腺癌組織明確其HER2狀態(tài)。對(duì)48例乳腺癌組織的質(zhì)譜成像分析顯示HER2狀態(tài)與特異性多肽/蛋白的表達(dá)改變相關(guān)，這些多肽/蛋白的表達(dá)改變能區(qū)分癌組織與正常組織，其敏感性達(dá)83%，特異性達(dá)92%，總體準(zhǔn)確率達(dá)89%。富含半胱氨酸的小腸蛋白1被認(rèn)為是與HER2過(guò)表達(dá)密切相關(guān)的蛋白之一，并被證實(shí)應(yīng)用該蛋白的質(zhì)譜圖像可以建立乳腺癌診斷的新方法。Reyzer等［28］對(duì)HER2轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)了一組能預(yù)測(cè)分子靶向治療效果的蛋白，研究結(jié)果顯示用HER2受體抑制劑Herceptin對(duì)患乳腺癌的老鼠進(jìn)行治療，當(dāng)胸腺素β4和泛素下降超過(guò)80%時(shí)，癌組織出現(xiàn)癌細(xì)胞增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及體積減小。同時(shí)該研究組應(yīng)用質(zhì)譜成像技術(shù)證實(shí)，這兩種蛋白在老鼠體內(nèi)的分布與抑制劑的分布基本一致，且該預(yù)測(cè)作用具有時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。質(zhì)譜成像還被用于分析乳腺癌蛋白表達(dá)的異質(zhì)性［1-2］。Seeley 等［1］的研究表明，同一張乳腺癌組織切片的不同區(qū)域會(huì)產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)譜圖像，這表明腫瘤中不同種類(lèi)蛋白質(zhì)有其特定的空間分布特征，且與正常組織蛋白質(zhì)的空間分布不同。該研究的對(duì)象為發(fā)生乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，m/z 11 307的蛋白在癌組織和和正常淋巴組織中均有分布，m/z 9004的蛋白僅分布在癌組織浸潤(rùn)最活躍的部位，m/z 5358的蛋白則僅分布于正常組織。Seeley等［2］的另一項(xiàng)研究證實(shí)了3種蛋白在乳腺癌組織中的空間分布確有不同:組蛋白H2A集中分布于乳腺導(dǎo)管癌原發(fā)部位，calgizzarin主要分布于乳腺導(dǎo)管癌浸潤(rùn)區(qū)，而胸腺素β4則集中分布于乳腺導(dǎo)管癌間質(zhì)中。Dekker等［29］應(yīng)用質(zhì)譜成像方法比較乳腺癌患者腫瘤內(nèi)、外間質(zhì)區(qū)的信號(hào)差異，發(fā)現(xiàn)了與腫瘤間質(zhì)活化密切相關(guān)的4個(gè)蛋白信號(hào)，其中一個(gè)蛋白信號(hào)被確認(rèn)為PA28。Kang等［30］應(yīng)用質(zhì)譜成像串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)乳腺癌組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白重鏈A2是乳腺癌微環(huán)境的區(qū)域特異性蛋白，該蛋白的表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表達(dá)該蛋白的淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)提升了3.745倍。

質(zhì)譜成像技術(shù)同樣被用于組織溶解福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)乳腺癌組織的成像。Ronci等［31］在組織溶解FFPE乳腺癌組織質(zhì)譜成像研究中探討了FFPE組織分析的諸多復(fù)雜因素，論述了利用原位溶解增加檢測(cè)到和識(shí)別的蛋白質(zhì)數(shù)量的方法，并應(yīng)用原位溶解質(zhì)譜成像發(fā)現(xiàn)了一組能夠準(zhǔn)確區(qū)分乳腺癌組織和正常組織的胰蛋白酶肽。

質(zhì)譜成像技術(shù)也被用于已知蛋白的靶向性成像。Seuma等［32］利用Au/Ag標(biāo)記抗體技術(shù)及定量元素成像-激光消融電感耦聯(lián)血漿質(zhì)譜對(duì)已知的備選標(biāo)志物進(jìn)行定量成像，證實(shí)該方法具有良好的可重復(fù)性和定量特性。應(yīng)用這種已知蛋白靶向性成像研究方法可對(duì)近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的大量血清/血漿蛋白譜研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析。Callesen等［33］在其發(fā)表的一篇應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)找尋乳腺癌診斷標(biāo)志物可重復(fù)性的綜述中認(rèn)為，盡管各研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)條件、數(shù)據(jù)分析方法及分析的可重復(fù)性存在差異，但從這些研究中足以找出一組具有良好可重復(fù)性的乳腺癌診斷差異蛋白，應(yīng)用乳腺癌組織芯片的抗體標(biāo)記靶向性成像方法就可驗(yàn)證這些待確證蛋白是否為乳腺癌診斷差異蛋白。

質(zhì)譜成像在乳腺癌脂類(lèi)分子的研究中也有應(yīng)用。Chughtai等［34］將 MDA-MB-231細(xì)胞注射進(jìn)無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)，待瘤荷達(dá)500 mm2時(shí)處死裸鼠，應(yīng)用離子遷移質(zhì)譜陽(yáng)離子模式進(jìn)行質(zhì)譜成像，明確腫瘤內(nèi)?；舛緣A、鞘磷脂類(lèi)、甘油磷脂酰膽堿等脂類(lèi)分布信息。質(zhì)譜成像的定量研究特性顯示，腫瘤組強(qiáng)酰基肉毒堿、鞘磷脂類(lèi)、甘油磷脂酰膽堿較正常組織存在數(shù)量差異。這項(xiàng)關(guān)于乳腺癌微環(huán)境的脂類(lèi)組成的研究證實(shí)，乳腺癌的脂類(lèi)組成與乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Kawashima等［35］對(duì)9例乳腺癌患者的癌組織和1例正常人乳腺組織進(jìn)行質(zhì)譜成像分析，發(fā)現(xiàn)了10種由異常脂肪酸組成的磷脂酰肌醇脂類(lèi)，該組脂類(lèi)在乳腺癌組織惡性上皮區(qū)的分布并不一致，能夠區(qū)分上皮區(qū)的癌組織和周?chē)g質(zhì)組織。該研究還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)磷脂酰肌醇(18∶0/20∶3)的乳腺癌組織更具侵襲性。Ide等［36］對(duì)29例乳腺癌組織進(jìn)行質(zhì)譜成像分析，以了解磷脂酰膽堿脂類(lèi)和溶血磷脂膽堿脂類(lèi)在乳腺癌組織中的空間分布，結(jié)果顯示4 種磷脂酰膽堿(32∶1、34∶1、36∶1、34∶0)僅分布在癌組織區(qū)，溶血磷脂膽堿脂類(lèi)在癌區(qū)和非癌區(qū)的分布并無(wú)差異，磷脂酰膽堿(36∶1)∶磷脂酰膽堿(36∶0)的比率和磷脂酰膽堿(36∶1)∶溶血磷脂膽堿(18∶0)的比率在癌區(qū)相對(duì)于非癌區(qū)高。

3 小結(jié)

質(zhì)譜成像技術(shù)在腫瘤組織的識(shí)別、腫瘤亞型及惡性程度的區(qū)分、良惡性腫瘤的鑒別以及腫瘤藥物的研究等多個(gè)腫瘤研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，究其原因在于其可以非靶向性地同時(shí)研究多種分子的空間分布特征。除多肽/蛋白質(zhì)外，質(zhì)譜成像可用于其他多種類(lèi)型分子的研究，如脂類(lèi)［37］、代謝物［38］等，只是樣本準(zhǔn)備方法不同。此外，質(zhì)譜成像還具備與其他已經(jīng)建立的體內(nèi)、體外研究方法聯(lián)合應(yīng)用的潛能。目前，質(zhì)譜成像組織分類(lèi)均是以組織學(xué)分析為基礎(chǔ)［8，39-40］。經(jīng)組織學(xué)標(biāo)記過(guò)的組織切片質(zhì)譜信號(hào)被用來(lái)創(chuàng)建分類(lèi)模型，隨后用其他切片對(duì)該分類(lèi)模型進(jìn)行驗(yàn)證。質(zhì)譜成像可進(jìn)行組織學(xué)類(lèi)型分類(lèi)，證明其可被用于臨床，并有可能成為新的診斷/預(yù)后工具，但要驗(yàn)證質(zhì)譜成像的這些潛能，還需要進(jìn)行大樣本的實(shí)驗(yàn)研究，特別是針對(duì)臨床人群的研究［39］。同時(shí)，質(zhì)譜成像技術(shù)又獨(dú)立于組織學(xué)分析，因此能在病理性實(shí)體出現(xiàn)前就檢測(cè)到生化改變，基于質(zhì)譜成像技術(shù)的對(duì)備選蛋白標(biāo)志物的識(shí)別已得到部分研究證實(shí)［41-42］。未來(lái)基于組織芯片同步分析的分類(lèi)方法將成為質(zhì)譜成像發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物的主要發(fā)展方向，這種高通量研究方法將會(huì)使近來(lái)備受關(guān)注的高速基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)質(zhì)譜和自動(dòng)質(zhì)譜成像得到發(fā)展［43］。

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