RNA干擾技術(shù)及其在神經(jīng)病學中的研究進展

敖媛媛，孫洪英，楊國安(綜述)，和姬苓※(審校)

(內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科， 2中心實驗室，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象[1],這項技術(shù)為生命科學帶來了重大的革新，其迅速從實驗室技術(shù)走向?qū)Σ溉閯游锏倪z傳學研究中,并且在哺乳動物中調(diào)節(jié)RNAi的小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)在被發(fā)現(xiàn)后迅速用于開發(fā)治療人體疾病藥物[2]。在神經(jīng)病學的領(lǐng)域，RNAi不僅僅作為一種研究工具，其在機體中可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，其功能異?？蓪?dǎo)致某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生(如脆性X智力低下)[3]，在正常生理功能中RNAi亦有具有重要的功能,如維持正常的基因表達,染色體結(jié)構(gòu)和抗病毒功能[4]。在試驗研究中通過RNAi沉默特定基因，可用于研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制、開發(fā)目前無良好治療方法的神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物。

1 RNAi的過程

在以往的研究中發(fā)現(xiàn)植物中某些轉(zhuǎn)錄后的基因具有沉默其他通路的作用，隨后Wood等[5]發(fā)現(xiàn)“正義RNA”抑制同源基因表達的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA中污染了微量雙鏈RNA(dsRNA)而引發(fā)，并將這一現(xiàn)象命名為RNAi[6]。內(nèi)源性的雙鏈RNA分子經(jīng)過細胞核酸內(nèi)切酶Drosha的修飾[7]，隨后轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，再次經(jīng)過核酸內(nèi)切酶Dicer的修飾形成21～23個核苷酸長度的雙鏈RNA。這些雙鏈RNA可以和RNAi特異性結(jié)合，并且根據(jù)它們的功能和來源被分為兩類：siRNA和微RNA(mcroRNA，miRNA)[8]。在細胞質(zhì)中，“反義”或“正義”的雙鏈嵌入一個被稱為RISC(RNA induced silencing complex)蛋白復(fù)合體，并和序列互補的RNA相結(jié)合導(dǎo)致其靶標RNA的降解或者翻譯抑制[9]。

通過研究探明RNAi在中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮作用，有助于闡明RNAi在正常的腦功能及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中扮演的作用，并有助于推動RNAi治療在臨床神經(jīng)科學中的應(yīng)用。初步的研究表明，miRNA在哺乳動物大腦的不同區(qū)域發(fā)揮著不同的作用，并且RNAi在大腦的發(fā)育過程中具有重要的作用[10]。在非神經(jīng)元細胞中加入大腦中特異的miRNA后，可促使該非神經(jīng)元細胞表達的蛋白類型轉(zhuǎn)向神經(jīng)元細胞的表達蛋白類型，miRNA具有調(diào)控多種目的基因表達的功能，miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和身體其他部位能增強RNAi調(diào)控的作用[11]。通過生物信息學實驗預(yù)測，在人類基因組中有1/3的基因可以通過RNAi途徑調(diào)節(jié)[12]。

在人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中發(fā)現(xiàn)，大腦中RNAi亦發(fā)揮了重要的作用，X染色體易損綜合征是由脆性X智力障礙蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)基因突變引起的遺傳性智力低下，正常FMRP可以調(diào)控突觸的可塑性，而神經(jīng)元中FMRP的表達由RNAi調(diào)控，RNAi的異常即可導(dǎo)致FMRP的表達異常[13]。可見，RNAi途徑的異?？赡苁菍?dǎo)致神經(jīng)性疾病發(fā)病機制的基礎(chǔ)。

2 開發(fā)具有治療潛力的RNAi

在臨床中開發(fā)能夠有效治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物仍然是一個難題。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是人體中最特別的器官，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)大量神經(jīng)細胞聚集在一起，有機地構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)或回路[14]。由于神經(jīng)元無法進行有絲分裂，一旦受到損害就很難恢復(fù)正常[15]。臨床神經(jīng)科學的一個重要研究目標就是如何有效地改善和治療神經(jīng)變性疾病中產(chǎn)生的神經(jīng)損傷，而目前RNAi被認為具有開發(fā)成該類藥物的重大潛力。

在許多神經(jīng)變性疾病中，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙或細胞損傷的生物學基礎(chǔ)目前尚未得到完整、透徹的研究，但是對于發(fā)病相關(guān)的基因及相關(guān)基因產(chǎn)物的研究目前已經(jīng)相對成熟，在這些疾病中表達有缺陷的蛋白對神經(jīng)元細胞產(chǎn)生毒性，而沉默致病基因可有效預(yù)防有毒蛋白的積累是一種有效的治療手段[16]。目前，腦神經(jīng)變性疾病治療性RNAi的研究已取得一定成功，但其應(yīng)用到臨床前仍需進一步地深入研究，目前在非神經(jīng)疾病領(lǐng)域(如病毒性肝炎和癌癥)治療性RNAi的研究也在逐步開展[17]。

在治療性RNAi的設(shè)計中，治療性RNAi必須能夠特異性靶向沉默變異蛋白而不影響機體正常蛋白的表達。特別是在由遺傳變異導(dǎo)致的毒性或者負顯性作用蛋白表達的疾病中?？紤]到靶點蛋白的正常生理功能，如果靶標基因不是一個必需基因，目標基因和等位基因均可采用非特異性靶標結(jié)合；但如果同時沉默兩種等位基因是有害的，則必須保護野生型基因的正常表達，例如亨廷頓舞蹈病。在疾病中功能或者必需蛋白尚未研究清楚時(如原發(fā)性肌張力障礙是由于DYT1基因突變所導(dǎo)致的疾病)最合適的方式是尋找突變等位基因的特異性靶點，這樣才能同時保證野生型基因的正常表達，維持機體的正常狀態(tài)和生理機制[18]。目前，等位基因特異性沉默已經(jīng)在多種疾病中證實具有可行性。

3 靶標特異的神經(jīng)系統(tǒng)疾病

3.1等位基因特異性沉默 DYT1是最常見的遺傳肌張力障礙，雖然DYT1的發(fā)病機制尚不明確，但多種研究表明RNAi治療適用于DYT1：①DYT1中的突變蛋白torsinA由于負顯性表達而產(chǎn)生神經(jīng)毒性[19]。②所有類型DYT1都是由于DYT1基因中GAG堿基缺失導(dǎo)致的[20]。③DYT1肌張力障礙中神經(jīng)元退變在病理、生理學上是可逆的[21]。在細胞培養(yǎng)實驗中，野生型和突變基因之間的三個核苷酸差異已經(jīng)允許使用siRNA等位基因特異性沉默突變基因。

當野生型和突變等位基因僅僅相差一個核酸時，siRNA可以通過單核苷酸序列的不同進行區(qū)分，例如在額顳葉癡呆中tau的突變[22]。家族性肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥是由于一個乙酰膽堿受體亞單位突變所導(dǎo)致的先天肌無力，導(dǎo)致其中超氧化物歧化酶基因突變的等位基因目前已經(jīng)可以識別[23]。但不同于DYT1肌張力障礙,所有這些疾病中基因突變均為非均質(zhì)性的，這要求針對不同的突變設(shè)計不同的siRNA。

3.2針對偶發(fā)性疾病 非遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病比基因突變所導(dǎo)致的疾病更為常見，如阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)和偏頭痛等。AD是最常見的神經(jīng)退行性疾病，AD進行siRNA干預(yù)治療的研究也進行的最為深入，對于AD發(fā)病機制的研究表明β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)家族在AD的發(fā)病中具有至關(guān)重要的作用[24]。研究者嘗試采取不同的RNAi方法對其進行治療，如直接沉默Aβ的前體-淀粉樣前體蛋白的表達[25]；沉默Aβ生成所需的兩種蛋白酶之一β分泌酶；或沉默AD神經(jīng)元的神經(jīng)纖維纏結(jié)的tau蛋白的表達，這些推測需進一步在實驗動物模型上進行證實。

RNAi是否能夠有效的沉默靶基因并不是唯一需要考慮的問題，當準備把RNAi推廣使用到人體上時仍然有許多問題需要面對，例如何時開始進行治療、靶基因是進行持續(xù)沉默還是間歇沉默、治療維持多長時間。這些問題對于RNAi的推廣使用均具有非常重要的作用。此外，RNAi的安全性值得進一步考慮，其是否會傷害到人體的神經(jīng)元細胞仍值得商榷。

4 體內(nèi)RNAi治療研究

體外研究成功證實了RNAi對于神經(jīng)性病變的治療作用，而進一步的實驗需在動物體內(nèi)開展。通過在轉(zhuǎn)基因小鼠模型上進行研究收集實驗數(shù)據(jù)，為將RNAi應(yīng)用于人類治療提供理論基礎(chǔ)。但是，RNAi藥物是否能夠有效進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一個巨大的問題，單純口服或靜脈注射無修飾的RNAi均無法取得良好的效果，因為短鏈核酸無法通過血腦屏障到達靶標神經(jīng)元細胞，直接注射無修飾RNAi進入腦實質(zhì)亦未取得良好的治療效果，但有報道稱通過注射高濃度RNAi進入室性腦脊液取得了成功[26]。但目前大部分研究均認為單純的未經(jīng)修飾的RNAi不適合作為治療藥物[27]。目前有研究報道稱，為RNAi連接上載體分子可促進藥物的吸收，Gitlin等[28]研究顯示在RNAi上連接上膽固醇灌胃給藥可以促進藥物在小鼠上的肝靶向性和腸道靶向性，據(jù)此可推測在RNAi上連接膽固醇或者其他脂質(zhì)通過腦室灌注可有效促進藥物擴散到神經(jīng)細胞，另一項研究顯示RNAi上連接細胞穿膜肽可有效促進藥物和神經(jīng)細胞結(jié)合。這些研究都證實，選擇合理的載體可以促進RNAi在機體中的吸收[29]。

有研究報道，RNAi不適用于慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，大多數(shù)神經(jīng)變性疾病需要長期的沉默致病基因，而RNAi在單次給藥后，沉默效果無法維持足夠長的時間[30]。有研究報道，通過系統(tǒng)編碼短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)可以延長RNAi的時效，shRNA包括兩個短反向重復(fù)序列，中間由一個莖環(huán)(loop)序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由pol Ⅲ啟動子控制；隨后再連上5～6個胸腺嘧啶作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子,在活體中輸送siRNA的一種辦法是將siRNA序列作為“短發(fā)夾”克隆進質(zhì)粒載體中[31]。當送入動物體內(nèi)時，該發(fā)夾序列被表達出來，形成一個“雙鏈RNA”(dsRNA)，并被RNAi通道處理，shRNA可以通過血腦屏障并到達預(yù)定的靶標神經(jīng)細胞，這項實驗技術(shù)已經(jīng)在嚙齒類動物腦癌的治療中得到確證。

通過腦實質(zhì)內(nèi)注射以病毒為載體的shRNA，該方法以病毒載體傳遞shRNA至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Davidson等[32]在綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠上證實了該方法，在小鼠紋狀體注射shRNA表達的腺病毒后可以觀察到顯著的沉默轉(zhuǎn)基因。隨后的研究顯示，在嚙齒動物中腦注射shRNA表達的腺病毒(adeno-associated virus，AAV)可以表現(xiàn)出長期的抑制內(nèi)源性酪氨酸羥化酶活性的作用[33]。Davidson等[34]研究顯示，以AAV為基礎(chǔ)的shRNA可以部分抑制小鼠脊髓小腦的共濟失調(diào)1型臨床、病理學和細胞學癥狀。在小鼠亨廷頓氏舞蹈病模型中采用AAV和貓免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)的shRNA傳遞系統(tǒng)取得類似的結(jié)果。兩個最新的報道顯示，shRNA表達的慢病毒能夠進入家族性肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥小鼠模型脊髓前角運動神經(jīng)元，改善它們的行為和病理學變化，提高模型小鼠的存活率[35-36]。這些研究通過建立以病毒為載體的shRNA傳遞體，以獲得RNAi在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的長期治療。目前的研究重點在于病毒載體能夠通過靈長類的血腦屏障，并且在腦內(nèi)達到足夠的治療濃度。

5 結(jié) 語

RNAi在神經(jīng)系統(tǒng)功能中具有重要的作用，RNAi調(diào)控技術(shù)目前已成為一個非常重要的實驗技術(shù)，并且為許多無法治愈的神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了其他的治療選擇。隨著對RNAi機制進一步地深入了解，以RNAi為基礎(chǔ)的藥物將會具有更大的應(yīng)用前景。但是，目前的研究多為在實驗室水平考察RNAi對多種神經(jīng)性疾病小鼠模型的治療作用，雖然取得了良好的治療效果，但其仍需要在進一步臨床前研究考察治療性RNAi的有效性和安全性。通過對RNAi在神經(jīng)病領(lǐng)域的積極研發(fā)，RNAi技術(shù)定能逐步運用于神經(jīng)變性疾病的臨床治療中。

[1] Abdelgany A,Wood M,Beeson D.Allele-specific silencing of a pathogenic mutant acetylcholine receptor subunit by RNA interference[J].Hum Mol Genet,2003,15(20):2637-2644.

[2] Akaneya Y,Jiang B,Tsumoto T.RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region[J].J Neurophysiol,2005,93(1):594-602.

[3] Xia H,Mao Q,Eliason SL,etal.RNAi suppresses polyglutamine-induced neurodegeneration in a model of spinocerebellar ataxia[J].Nat Med,2005,10(8):816-820.

[4] Xia H,Mao Q,Paulson HL,etal.siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo[J].Nat Biotechnol,2002,20(10):1006-1010.

[5] Wood MJ,Trülzsch B,Abdelgany A,etal.Therapeutic gene silencing in the nervous system[J].Hum Mol Genet,2003,12(2):R279-R284.

[6] Alabi C,Vegas A,Anderson D.Attacking the genome:emerging siRNA nanocarriers from concept to clinic[J].Curr Opin Pharmacol,2012,12(4):427-433.

[7] Wilson JF.Gene therapy yields to RNA interference[J].Ann Intern Med,2005,143(2):161-164.

[8] Verdel A,Jia S,Gerber S,etal.RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex[J].Science,2004,303(5658):672-676.

[9] Vargason JM,Szittya G,Burgyan J,etal.Size selective recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor[J].Cell,2003,115(7):799-811.

[10] Trotta N,Orso G,Rossetto MG,etal.The hereditary spastic paraplegia gene,spastin,regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function[J].Curr Biol,2004,14(13):1135-1147.

[11] Thakker DR,Natt F,Husken D,etal.Neurochemical and behavioral consequences of widespread gene knockdown in the adult mouse brain by using nonviral RNA interference[J].Proc Natl Acad Sci,2004,101(49):17270-17285.

[12] Stevenson M.Therapeutic potential of RNA interference[J].N Engl J Med,2004,351(17):1772-1777.

[13] Stark GR,Kerr IM,Williams BR,etal.How cells respond to interferons[J].Annu Rev Biochem,1998,67:227-264.

[14] Sledz CA,Holko M,Williams BR,etal.Activation of the interferon system by short-interfering RNAs[J].Nat Cell Biol,2003,5(9):834-839.

[15] Seitz H,Royo H,Bortolin ML,etal.A large imprinted microRNA gene cluster at the mouse Dlk1-Gtl2 domain[J].Genome Res,2003,14(9):1741-1748.

[16] Schwarz DS,Hutvagner G,Du T,etal.Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex[J].Cell,2003,115(2):199-208.

[17] Pardridge WM.Intravenous,non-viral RNAi gene therapy of brain cancer[J].Expert Opin Biol Ther,2004,4(7):1103-1113.

[18] Paddison PJ,Caudy AA,Hannon GJ.Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci,2003,99(3):1443-1448.

[19] Miller VM,Xia H,Marrs GL,etal.Allele-specific silencing of dominant disease genes[J].Proc Natl Acad Sci,2003,100(12):7195-7200.

[20] Lipton RB,Dodick DW.CGRP antagonists in the acute treatment of migraine[J].Lancet Neurol,2004,3(13):332.

[21] Lagos-Quintana M,Rauhut R,Yalcin A,etal.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J].Curr Biol,2002,12(9):735-739.

[22] Kao SC,Krichevsky AM,Kosik KS,etal.BACE1 Suppression by RNA interference in primary cortical neurons[J].J Biol Chem,2003,279(3):1942-1949.

[23] Kalidas S,Smith DP.Functional genomics,fragile X syndrome,and RNA interference[J].Arch Neurol,2003,60(9):1197-1200.

[24] Johnston RJ,Hobert O.A microRNA controlling left/right neuronal asymmetry in Caenorhabditis elegans[J].Nature,2003,426(6968):845-849.

[25] Holen T,Mobbs CV.Lobotomy of genes:Use of RNA interference in neuroscience[J].Neuroscience,2004,126(1):1-7.

[26] Santos SD,Lambertsen KL,Clausen BH,etal.CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia[J].J Neurochem,2010,115(6):1434-1444.

[27] Hardy J,Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease:Progress and problems on the road to therapeutics[J].Science,2002,297(5580):353-356.

[28] Gitlin L,Karelsky S,Andino R.Short interfering RNA confers intracellular antiviral immunity in human cells[J].Nature,2002,418(6896):430-434.

[29] Fahn S,Bressman SB,Marsden CD.Classification of dystonia[J].Adv Neurol,1998,78:1-10.

[30] Chen S,Ge X,Chen Y,etal.Advances with RNA interference in Alzheimer′s disease research[J].Drug Des Devel Ther,2013,7(2):117-125.

[31] DeKosky ST,Marek K.Looking backward to move forward:Early detection of neurodegenerative disorders[J].Science,2003,3302(5646):830-834.

[32] Davidson BL,Breakefield XO.Viral vectors for gene delivery to the nervous system[J].Nat Rev Neurosci,2003,44(5):353-364.

[33] Davidson BL,Paulson HL.Molecular medicine for the brain:Silencing of disease genes with RNA interference[J].Lancet Neurol,2004,3(3):145-149.

[34] Davidson TJ,Harel S,Arboleda VA,etal.Highly efficient small interfering RNA delivery to primary mammalian neurons induces MicroRNA-like effects before mRNA degradation[J].J Neurosci,2004,24(45):10040-10046.

[35] Gonzalez-Alegre P,Miller VM,Davidson BL,etal.Toward therapy for DYT1 dystonia:Allele-specific silencing of mutant TorsinA[J].Ann Neurol,2003,53(6):781-787.

[36] Kuzma-Kozakiewicz M,Kwiecinski H.New therapeutic targets for amyotrophic lateral sclerosis[J].Expert Opin Ther Targets,201,15(2):127-143.