生長(zhǎng)分化因子5調(diào)控細(xì)胞分化機(jī)制研究新進(jìn)展

張文婷(綜述)，羅飛宏(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科，上海 201102)

生長(zhǎng)分化因子5(growth differentiation factor-5,GDF-5)，又稱骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)14或軟骨衍生蛋白1，是1994年發(fā)現(xiàn)的一種生長(zhǎng)因子，其基因由H?tten等[1]從人的cDNA庫中首次克隆得到。GDF-5作為胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、機(jī)體軟骨形成、骨骼發(fā)育等的重要調(diào)節(jié)因子，近年來受到廣泛關(guān)注與研究。該文就其作用機(jī)制及潛在的作用途徑予以綜述。

1 GDF-5家族與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族

GDF-5隸屬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族，TGF-β家族是一類具有保守結(jié)構(gòu)的二聚體蛋白，含近30個(gè)分泌信號(hào)分子，已發(fā)現(xiàn)9個(gè)亞族，另有BMP-2亞族、BMP-5亞族、Vg1亞族、BMP-3亞族、中間成員、活性素亞族、TGF-β亞族和“遠(yuǎn)房”成員等，共27類因子[2-3]。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上既有相同點(diǎn)又有不同的特征，主要介導(dǎo)組織的正常生長(zhǎng)、發(fā)育，包括細(xì)胞分化、增殖、遷移和死亡。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)將其分為三類：TGF-β、激活素、骨形成蛋白。一些分子還可以再分成亞家族[4]，生物活性包括：①作用于早期胚胎使之形成相應(yīng)組織結(jié)構(gòu)；②刺激形成軟骨，骨和性器官；③通過增強(qiáng)血纖溶酶原的催化活性誘導(dǎo)血管形成；④抑制上皮生長(zhǎng)；⑤調(diào)節(jié)重要免疫和內(nèi)分泌功能；⑥傷口修復(fù)等。

2 GDF-5的結(jié)構(gòu)

GDF-5基因定位于20q11.2染色體，全長(zhǎng)488 kb，共含有501個(gè)氨基酸，包括N端的信號(hào)肽，中間的前體肽和C端的成熟肽。翻譯后的前體蛋白裂解成為成熟肽，成熟肽發(fā)揮生物活性作用，成熟的GDF-5蛋白含120個(gè)氨基酸殘基，以二聚體形式存在。其成熟蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)主要由7個(gè)鏈間二硫鍵維持，半胱氨酸殘基在決定結(jié)構(gòu)和功能方面至關(guān)重要。7個(gè)半胱氨酸殘基中的任何一個(gè)被絲氨酸替代，都可使GDF-5活性顯著降低[5]。

3 GDF-5作用機(jī)制

GDF-5 mRNA表達(dá)主要集中在胚胎軟骨間充質(zhì)細(xì)胞聚集區(qū)、長(zhǎng)骨發(fā)育的軟骨核以及即將形成關(guān)節(jié)的區(qū)域[6]。在軟骨發(fā)育初期，GDF-5分泌于肢體骨間質(zhì)區(qū)從而募集軟骨前體細(xì)胞并促進(jìn)其分化，之后GDF-5在即將形成關(guān)節(jié)的區(qū)域表達(dá)[7]。GDF-5與BMPⅠ型受體及Ⅱ型受體結(jié)合，組裝成預(yù)成型復(fù)合體或者BMP介導(dǎo)的信號(hào)通路復(fù)合體[8-9]。通過形成預(yù)成型復(fù)合體，BMPⅡ型受體、BMPⅠ型受體A/B亞型受體依次磷酸化而活化，繼而作用于R-Smads(Smad1/5/8)使其活化，活化的R-Smads同Smad4形成雜聚肽復(fù)合體并進(jìn)入細(xì)胞核特定的DNA區(qū)域誘導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄。除此之外，GDF-5可以與高親和力的Ⅰ型受體先行結(jié)合，再募集低親和力的Ⅱ型受體形成BMP介導(dǎo)的信號(hào)通路復(fù)合體，從而啟動(dòng)不需Smads介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如GDF-5可以通過誘導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10-11]。

4 GDF-5與骨修復(fù)

GDF-5與富含Ⅰ型膠原組織(如皮質(zhì)骨)的結(jié)構(gòu)、功能關(guān)系密切，GDF-5Bp-J/+鼠在關(guān)節(jié)炎模型中表現(xiàn)出明顯的膠原纖維排列紊亂[12]。GDF-5缺乏的短肢BP小鼠的骨折修復(fù)存在1～2周的延遲[13]。

Park等[14]在10只比格犬的兩邊下顎第2和第4前磨牙周圍做出4 mm×5 mm(寬×長(zhǎng))標(biāo)準(zhǔn)大小的深入骨質(zhì)的缺損，并將它們隨機(jī)分成兩組：一組使用高劑量的人重組GDF-5聚乙丙交酯(poly-lactide-co-glycolide-acid,PLGA)載體(188 μg/缺損)填充與不作填充對(duì)照(5只)；另一組進(jìn)行使用低劑量的重組人生長(zhǎng)分化因子5(recombinant human growth differentiation factor5,rhGDF-5)PLGA載體(37 μg/缺損)填充與不含rhGDF-5的載體填充對(duì)照。24周后進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析得出臨床愈合狀態(tài)不一致，高劑量的rhGDF-5顯著增加了骨的形成，促進(jìn)再生骨的成熟，并且沒有異常愈合狀況的發(fā)生。Leknes等[15]也發(fā)現(xiàn)含rhGDF-5的鈦移植物可以大幅度提高礦化組織的形成，這種作用與劑量呈正比。

5 GDF-5與軟骨生成

Cho等[16]發(fā)現(xiàn)在大鼠脛骨骨折的修復(fù)過程中，GDF-5僅在第7～14天時(shí)表達(dá)，并在第7天出現(xiàn)峰值表達(dá)，此時(shí)正是骨折修復(fù)過程的軟骨形成期。Coleman等[17]也指出在剔除GDF-5的小鼠的長(zhǎng)骨修復(fù)過程中，早期骨修復(fù)過程存在明顯延遲，而骨修復(fù)早期是軟骨細(xì)胞的形成與重構(gòu)時(shí)期。另有報(bào)道指出，GDF-5在骨骼發(fā)育初期主要是促進(jìn)軟骨祖細(xì)胞在一定部位聚集、黏附，后期則能刺激軟骨細(xì)胞增生、肥大[18]。

Bobacz等[19]在研究腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的慢性關(guān)節(jié)炎模型小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因鼠在關(guān)節(jié)軟骨區(qū)GDF-5和BMP-7的表達(dá)下降，軟骨細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的應(yīng)答也呈下降態(tài)勢(shì)，這種下調(diào)妨害了組織的修復(fù)，同時(shí)在滑膜區(qū)GDF-5和BMP-7的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致了關(guān)節(jié)滑液囊的肥大，上述的發(fā)現(xiàn)說明慢性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與生長(zhǎng)因子在軟骨區(qū)的表達(dá)下調(diào)和軟骨細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子反應(yīng)低下有關(guān)。

Alexander等[20]從3位志愿者身上提取了鼻中隔軟骨細(xì)胞，研究者將軟骨細(xì)胞在人類血清中擴(kuò)增，并將其分為兩組；一組培養(yǎng)在含2%人類血清的海藻酸鹽中，另一組培養(yǎng)在含10%人類血清的海藻酸鹽中，同時(shí)將胰島素樣生長(zhǎng)因子1、BMP-2、BMP-7、BMP-13、GDF-5、TGF-β、胰島素和地塞米松的不同組合物加入上述培養(yǎng)液中，分別培養(yǎng)2周。2周后，通過測(cè)定糖胺聚糖的聚集量，選出聚集最多量糖胺聚糖的胰島素樣生長(zhǎng)因子1和GDF-5組進(jìn)行第二階段的試驗(yàn)。在第二階段試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子1和GDF-5加入2%人類血清組與單純2%人類血清組相比，胰島素樣生長(zhǎng)因子1和GDF-5組可以募集更多的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原，生成的軟骨厚度是對(duì)照組的12倍。

6 GDF-5與脂肪來源間質(zhì)干細(xì)胞分化

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在特定培養(yǎng)條件下可以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞[21-22]，并且將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植至受損傷部位可以加強(qiáng)組織的修復(fù)[23-24]。近年來，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，即脂肪干細(xì)胞，因其與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的分化潛能、對(duì)特定誘導(dǎo)環(huán)境的高反應(yīng)及來源廣泛易于分離提取成為了研究的熱點(diǎn)[25-26]。

Zeng等[27]在研究小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入了GDF-5的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，在第4天就可以檢測(cè)到Cbfa1/Runx2(一種在骨形成早期表達(dá)的轉(zhuǎn)化因子)mRNA的高表達(dá)，而對(duì)照組僅在第14天微弱地表達(dá)了該基因，同時(shí)von Kossa染色證實(shí)GDF-5組礦化作用的證據(jù)最充分，同樣，GDF-5組上調(diào)了堿性磷酸酶(與骨細(xì)胞團(tuán)活性相關(guān))的活性及其基因的水平，以上三點(diǎn)充分說明了GDF-5在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化早期即可完全地促進(jìn)其分化為骨細(xì)胞。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，GDF-5在細(xì)胞培養(yǎng)第14天可以顯著地上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的基因表達(dá)，VEGF在骨分化過程中的具體作用尚不明確，然而有研究證實(shí)人重組VEGF-165能刺激骨的形成，提示GDF-5在骨再生方面的作用可能是多方面的[28-29]。

Feng等[30]在研究脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，GDF-5對(duì)于促進(jìn)脂肪干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞亦有重要作用，與對(duì)照組相比較，GDF-5組Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖基因(軟骨細(xì)胞特異性基因)的表達(dá)顯著增高，且不會(huì)促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白和X型膠原蛋白(軟骨細(xì)胞肥大的標(biāo)志)的表達(dá)，這種作用以100 μg/L的濃度為最佳。

Park等[31]發(fā)現(xiàn)，GDF-5可以促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肌腱組織細(xì)胞，并且這種作用是時(shí)間和濃度依賴性的。肌腱組織細(xì)胞外基質(zhì)、Ⅰ型膠原、蛋白聚糖在100 μg/L GDF-5濃度時(shí)表達(dá)增加；而另一細(xì)胞外基質(zhì)核心蛋白聚糖在1 μg/L和10 μg/L GDF-5濃度時(shí)表達(dá)增加。肌腱組織細(xì)胞特有的標(biāo)志物堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子、腱調(diào)蛋白在100 μg/L GDF-5濃度時(shí)表達(dá)增加，而腱生蛋白C的表達(dá)在1000 μg/L GDF-5濃度下顯著增強(qiáng)。另外，研究還發(fā)現(xiàn)一些基質(zhì)修復(fù)蛋白(主要參與肌腱損傷的修復(fù))，如基質(zhì)金屬蛋白酶3及基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達(dá)在10和1000 μg/L GDF-5濃度時(shí)增高，而其抑制蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶抑制蛋白2的表達(dá)在100 μg/L和1000 μg/L GDF-5濃度時(shí)降低，這些蛋白與肌腱受損傷修復(fù)相關(guān)，說明GDF-5在肌腱損傷修復(fù)過程中也起到一定作用。

7 GDF-5與神經(jīng)元

GDF-5在腦部包括中腦在內(nèi)的較多區(qū)域表達(dá)，在腹側(cè)中腦中的表達(dá)高峰出現(xiàn)在鼠胚胎第14天，此時(shí)多巴胺能神經(jīng)元正經(jīng)歷終末分化[32]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過GDF-5治療的腹側(cè)中腦部細(xì)胞能增加多巴胺能神經(jīng)元的存活率、改善其形態(tài)，并能保護(hù)其不受 1甲基4苯基吡啶離子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[33-34]。Toulouse等[35]發(fā)現(xiàn)持續(xù)的GDF-5治療可以保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免受6-羥多巴胺的神經(jīng)毒性，這種保護(hù)作用可以在加入6-羥多巴胺之前、也可以在其加入之后發(fā)揮作用，這為帕金森綜合征的治療提供了一條新的線索。

8 GDF-5的其他作用

將30 μg GDF-5注射入韌帶損傷小鼠的膝關(guān)節(jié)，3周后，脛骨-韌帶-股骨復(fù)合物的強(qiáng)度增加了41%，硬度增加了60%，說明在韌帶損傷修復(fù)過程中GDF-5也有一定作用[36]。

有報(bào)道指出，在小鼠左心室心肌梗死模型中，GDF-5 mRNA的局部誘導(dǎo)表達(dá)在心肌梗死發(fā)生后的第7天顯著升高。GDF-5剔除的小鼠心肌梗死瘢痕擴(kuò)大，左心室變大，左心室的彈性變差[37]。

9 結(jié) 語

GDF-5有廣泛地促進(jìn)細(xì)胞分化的作用，能促使骨折的修復(fù)、軟骨的生成、修復(fù)韌帶組織，誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞來源的間質(zhì)干細(xì)胞分化成骨、軟骨和肌腱等組織，在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)也表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用。GDF-5對(duì)于組織細(xì)胞以及機(jī)體干細(xì)胞的分化作用還有待于進(jìn)一步深入研究。

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