Pim-1基因在心血管疾病基礎(chǔ)研究中的進展

鄧曉江，鐘如智，黃師韻，葉楚莉(綜述)，揭 偉(審校)

(廣東醫(yī)學(xué)院 1第一臨床學(xué)院， 2基礎(chǔ)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東 湛江 524023)

絲氨酸/蘇氨酸激酶Pim-1基因最早是作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入點而被發(fā)現(xiàn)[1]，Pim家族還包括另外2個成員，即Pim-2和Pim-3，它們都包含一個被稱為ATP錨的活化位點。Pim-1基因產(chǎn)物屬于鈣離子/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶，并在多種細胞組織進化過程中高度保守[2]。Pim-1基因與細胞存活、增殖、分化、凋亡有關(guān)。Pim-1激酶在腫瘤中的作用已受到重視[3-6]。近年來發(fā)現(xiàn)，Pim-1激酶在血管平滑肌細胞[7-9]、心肌細胞[10]及血管內(nèi)皮細胞[11-12]中均有表達，提示Pim-1表達異常在心血管疾病中起重要作用。現(xiàn)就Pim-1基因在心血管疾病基礎(chǔ)研究中的進展予以綜述。

1 Pim-1基因與心肌梗死

心肌組織中Pim-1的表達與年齡相關(guān)。Pim-1高度表達于新生個體心臟中，但隨著年齡的增加，表達逐步降低。在細胞定位方面，小鼠幼稚心肌細胞中Pim-1多表達于細胞核，隨年齡的增長，其在細胞質(zhì)中的表達逐漸增多[13]。Pim-1細胞內(nèi)定位機制尚未清楚，目前認為其核內(nèi)表達可促進細胞增殖，而細胞質(zhì)中的表達可促進細胞存活[13-14]，因此Pim-1的功能與細胞內(nèi)定位有關(guān)。心肌梗死后，Pim-1表達水平上調(diào)，并以心肌梗死灶周圍殘存的心肌細胞胞質(zhì)表達為主[13]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后氧化應(yīng)激的存在可能是誘導(dǎo)Pim-1表達及增加Pim-1蛋白磷酸化水平的重要機制[8,15]。Pim-1表達上調(diào)后可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[16]。其他一些心肌保護因子(如紅細胞生成素、干細胞因子等)可顯著增加Pim-1的表達，所以Pim-1基因被認為是一種心臟保護因子。

Pim-1基因?qū)π呐K的保護作用可能與維持線粒體穩(wěn)定性、通過Bcl-2蛋白抗凋亡、抗心肌肥大及減少纖維化等方面有關(guān)[17]。這些作用已通過Pim-1轉(zhuǎn)基因動物實驗證實。Borillo等[18]發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)心肌細胞線粒體中Pim-1表達增加，從而穩(wěn)定線粒體膜電位，防止鈣超載引起的線粒體膜受損以及干擾氧化磷酸化過程，從而維持線粒體的超微結(jié)構(gòu)；同時，心肌細胞高表達Pim-1可提高抗凋亡基因Bcl-x(L)和Bcl-2的表達水平、抑制促凋亡Bid蛋白觸發(fā)的細胞色素C釋放，從而增加了心肌細胞的抗凋亡能力。在Pim-1基因缺陷的心肌細胞中發(fā)現(xiàn)，保護性線粒體相關(guān)蛋白包括Bcl-x(L)和Bcl-2表達水平下降，肌質(zhì)網(wǎng)對鈣重新攝取障礙及其引起的肌原纖維松弛，這些可能是由于肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶2a(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA2a)和鈉/鈣交換因子表達減少造成的[13]。鈣調(diào)節(jié)功能的失調(diào)增加了線粒體對Ca2+滲透性并促進活性氧生成，增加細胞凋亡，導(dǎo)致心肌細胞的死亡[18]。

由于Pim-1能增強心肌的再生能力，因而提出了基于Pim-1轉(zhuǎn)基因干細胞治療心肌梗死的策略[13,19-22]。Pim-1通過誘導(dǎo)c-myc、核干細胞素和細胞周期素E的表達來穩(wěn)定有絲分裂復(fù)合體及降解細胞周期素激酶抑制因子p27和p21，從而提高細胞的存活和增殖能力。作為Pim-1上游基因的蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱Akt)在心肌細胞核內(nèi)表達后可促進心肌細胞周期循環(huán)，并增加心臟祖細胞(cardiac progenitor cell,CPC)的數(shù)量[23]，從而起到保護心肌的作用[24]。應(yīng)用小干擾RNA抑制Akt信使RNA后可下調(diào)血管內(nèi)皮細胞中Pim-1的表達[12]。然而，心肌特異性Pim-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠其心臟中CPC的數(shù)量較野生型小鼠出生或心肌梗死應(yīng)激后未見明顯增加[24]，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Pim-1過表達可促進CPC非對稱性染色體分裂，并短暫性提高端粒酶活性，從而維持CPC數(shù)量[25-26]。Fischer等[21]和Mohsin等[22]在心肌梗死區(qū)植入Pim-1過表達的CPC后發(fā)現(xiàn)，其較植入野生型CPC具有更高的細胞移植率和更佳的遠期心功能改善效果，進一步從整體水平上證實了靶向Pim-1基因在心肌梗死治療中的價值。

2 Pim-1基因與疾病

2.1Pim-1基因與心肌肥厚 Muraski等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在Pim-1基因敲除的小鼠中雖未發(fā)現(xiàn)明顯的心肌病變，但卻加速了心肌細胞的凋亡過程，而在過度表達顯性失活的Pim-1基因中，除了發(fā)現(xiàn)體外心肌細胞凋亡外，還可觀察到3～4個月的小鼠左心室纖維化增加及膠原蛋白沉積，心肌壞死加重，導(dǎo)致心臟向擴張型心肌病發(fā)展。雖在這個過程中代償性地上調(diào)了Pim-2和Pim-3基因的水平，但并不能抑制心肌病變的發(fā)展[13]；以野生型Pim-1腺病毒過表達質(zhì)粒(Pim-WT)轉(zhuǎn)染于內(nèi)皮素1誘導(dǎo)的大鼠心肌細胞24 h后，發(fā)現(xiàn)Pim-WT的過度表達可抑制大鼠內(nèi)皮素1誘導(dǎo)的心肌細胞肥大[20]。Pim-1過表達后心肌細胞內(nèi)保護性蛋白SERCA2a水平、p21過磷酸化以及抗凋亡蛋白(如Bcl-xL、Bcl-2)水平都明顯增加，并且提高了Bad蛋白的磷酸化水平，使其失活，從而降低心肌纖維化、減少心肌壞死，改善心肌活力，維持心臟的收縮功能[13]。

2.2Pim-1基因與糖尿病性心肌病 糖尿病易導(dǎo)致心肌細胞損傷。Katare等[27]發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的小鼠1型糖尿病心肌中，Pim-1蛋白的表達水平隨心肌病變的加重而逐漸降低，相應(yīng)的Pim-1抑制因子——蛋白磷酸酶2A和微RNA1的表達水平上調(diào)。在Pim-1蛋白水平下降后，糖尿病性心肌細胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2的水平降低、促凋亡胱天蛋白酶3的活性升高，通過下調(diào)微RNA1后，Pim-1和Bcl-2的表達均得到相應(yīng)上調(diào)；糖尿病性心肌細胞在轉(zhuǎn)染Pim-1過表達質(zhì)粒后，可抑制體外高糖誘導(dǎo)的心肌細胞以及CPC凋亡。在誘導(dǎo)糖尿病模型第4周后通過靜脈注射Pim-1過表達腺病毒質(zhì)粒，可使心肌細胞內(nèi)Pim-1持續(xù)過表達，從而改善心肌舒張功能，防止左心室過度擴張及心力衰竭，并增加糖尿病心臟心肌細胞處于增殖期細胞的數(shù)量。Katare等[27]的研究結(jié)果提示，Pim-1在抗糖尿病性心肌細胞損傷中具有抗細胞凋亡和促進細胞增殖的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，Pim-1的高水平表達降低了線粒體內(nèi)膜電位極化，提高了心肌細胞抗氧化應(yīng)激能力，防止了Ca2+超載，保護了心肌細胞線粒體的完整性[18]，降低了糖尿病心肌細胞活性氧水平[27]，提高了心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性，從而改善了心臟功能[13]。

2.3Pim-1基因與血管平滑肌增殖相關(guān)性疾病 血管重構(gòu)性疾病，如高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等的特點是血管中膜增厚以及內(nèi)膜新生，這一重構(gòu)過程主要是由血管平滑肌細胞增殖以及細胞凋亡失調(diào)導(dǎo)致的[28]。Katakami等[8]首次報道Pim-1基因在球囊損傷后的大鼠頸動脈血管狹窄模型以及內(nèi)膜增厚的人冠狀動脈中表達增加。抑制Pim-1的表達后，在體內(nèi)可顯著抑制球囊損傷所導(dǎo)致的血管內(nèi)膜新生，在體外則延緩H2O2或血清誘導(dǎo)的平滑肌細胞周期的進展。Katakami等[8]的研究結(jié)果首次提出Pim-1的表達與平滑肌增殖呈正相關(guān)。Willert等[9]的研究結(jié)果提示，氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮生長因子A165和血管緊張素Ⅱ并不能增加血管平滑肌細胞中Pim-1的表達，而給與血小板源性生長因子-BB刺激后，Pim-1信使RNA的表達較對照組增加了3倍，其蛋白表達亦增加。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Janus活化的蛋白激酶，蛋白激酶C以及有絲分裂原激活蛋白激酶1/2信號的活化參與血小板源性生長因子-BB誘導(dǎo)的Pim-1表達[9]。然而，與Akt信號在血管內(nèi)皮細胞中的作用相反[12]，阻斷Akt信號并不干擾Pim-1表達的上調(diào)，表明了其信號調(diào)節(jié)的獨立性。Willert等[9]的研究提出了Pim-1參與血管重構(gòu)性疾病可能的分子機制。Meloche等[7]將新分離的人頸動脈血管平滑肌細胞暴露于晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)活化劑48 h后，可激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄活化子3(signal transducers and transcription activators 3,STAT3) 并增加Pim-1和活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)的表達。Pim-1可促使NFAT激活，而NFAT可減少Kv通道的開放，導(dǎo)致平滑肌細胞胞膜去極化，此去極化可刺激增殖的長效電壓門控鈣通道開放，增加鈣的攝入量，從而增強血管平滑肌細胞增殖和抗凋亡能力，促進血管重構(gòu)疾病表型轉(zhuǎn)化。相反，當給予RAGE抑制劑或針對Pim-1、STAT3和NFAT的siRNA后可逆轉(zhuǎn)在上述人頸動脈平滑肌細胞暴露于RAGE活化劑中出現(xiàn)的異常。上述研究提示，STAT3/Pim1/NFAT信號軸的活化在血管重構(gòu)性疾病中的作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，STAT3/Pim1/NFAT信號軸的活化在人類和實驗動物模型的肺動脈高壓中起關(guān)鍵作用，該信號活化后促進了平滑肌細胞的增殖和抗細胞凋亡[29]。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的急性糖尿病大鼠胸主動脈平滑肌細胞中Pim-1的表達較正常對照組明顯升高；體外高糖(25 mmol/L)刺激可明顯誘導(dǎo)原代大鼠胸主動脈平滑肌細胞Pim-1表達，并伴隨細胞增殖基因表達的增加，以及細胞周期的相應(yīng)變化，而給予Pim-1抑制劑槲皮萬壽菊素后抑制了高糖刺激誘導(dǎo)的平滑肌細胞的增殖。因此，糖尿病性動脈粥樣硬化一個發(fā)病機制可能與高糖刺激Pim-1表達而誘導(dǎo)血管平滑肌細胞增殖有關(guān)(待發(fā)表資料)。

2.5Pim-1基因與心血管疾病的治療 目前國外關(guān)于Pim-1基因在心血管疾病分子靶向治療中的研究逐漸受到重視，但國內(nèi)相關(guān)研究甚少。當前以美國圣地亞哥州立大學(xué)心臟研究所的Sussman團隊的研究成果居于前沿地位。其團隊發(fā)現(xiàn)，Pim-1通過上調(diào)nucleostemin的表達進而維持端粒的長度[30]；Pim-1轉(zhuǎn)基因心臟干細胞能增加細胞周期循環(huán)和不對稱分裂，影響心臟干細胞數(shù)目，有利于保存心臟干細胞池，以及提供心源性損傷修復(fù)所需的種子細胞[21,24-26,31]，因此，基因工程修飾的Pim-1過表達于心臟干細胞對缺血性心臟病細胞的治療可能是一種有效的選擇[32]。在具體操作上，為了避免全身非心臟器官的細胞受Pim-1表達的影響，應(yīng)選擇特異性針對靶器官或細胞的條件誘導(dǎo)方法[33]。在治療糖尿病性心肌病時，給予維生素B1類似物苯磷硫胺可通過調(diào)節(jié)Akt/Pim-1信號而提高心肌細胞的活性及功能[34]。鑒于STAT3/Pim1信號軸在肺動脈高壓的發(fā)病中也起了關(guān)鍵作用[35]，因此靶向干預(yù)Pim-1的表達對肺動脈高壓的治療將有益處。

3 小 結(jié)

鑒于Pim-1基因表達失常與缺血性心肌損傷、肺動脈高壓及血管重構(gòu)性疾病等重要心血管事件的密切關(guān)聯(lián)性，凸顯了靶向Pim-1分子治療的可行性和有效性。目前，在腫瘤研究領(lǐng)域中，針對Pim-1表達產(chǎn)物的特點來設(shè)計特異性化學(xué)抑制劑的研究正蓬勃發(fā)展。在今后，通過移植基因工程過表達Pim-1治療心肌梗死等缺血性心肌損傷或應(yīng)用Pim-1特異性化學(xué)抑制劑來治療肺動脈高壓、動脈粥樣硬化等涉及平滑肌細胞增殖性疾病將是一種可行性和有效性很強的策略。

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