小分子干擾RNA非病毒納米載體的設(shè)計(jì)進(jìn)展

鄭榮

上海市普陀區(qū)婦嬰保健院，上海 200062

將與內(nèi)源性m RNA序列相對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(doub lestranded RNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可使內(nèi)源性m RNA降解和基因沉默，這種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默機(jī)制稱(chēng)為RNA干擾(RNA interference，RNA i)[1]。小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約21-23個(gè)核苷酸單位的dsRNA分子，是RNA i發(fā)揮作用的中間效應(yīng)分子，它可以是內(nèi)源性的或外源性的[2]。雖然RNA i技術(shù)可在哺乳動(dòng)物體外培養(yǎng)的細(xì)胞中廣泛應(yīng)用，但其在體內(nèi)的應(yīng)用還是很有限的[3]。這主要是由于siRNA的核酸本質(zhì)所致：(1)由于血漿中核酸酶的存在，siRNA的半衰期不到15m in[4]；(2)siRNA的本質(zhì)為核酸，其負(fù)電性與極性導(dǎo)致其很難穿過(guò)脂質(zhì)雙分子層的細(xì)胞膜，裸露的siRNA在體內(nèi)不能快速透過(guò)血管內(nèi)皮、滯留于脾臟等血液儲(chǔ)存場(chǎng)所、易于被腎小球?yàn)V過(guò)、以及被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解[5]；(3)siRNA的脫靶效應(yīng)[6]；(4)siRNA的免疫原性刺激[7,8]。隨著RNA i在研究基因功能、治療遺傳相關(guān)疾病以及抗癌藥物方面的快速發(fā)展，siRNA的體內(nèi)運(yùn)送成為備受關(guān)注的問(wèn)題。因此，要將siRNA分子成功導(dǎo)入生物體并發(fā)揮有效的治療作用，首先應(yīng)解決載體問(wèn)題。由于生物體內(nèi)直接應(yīng)用siRNA分子的限制，大多數(shù)研究都借助于給藥載體：包括病毒載體和非病毒載體兩類(lèi)。盡管病毒載體給藥系統(tǒng)在體外的轉(zhuǎn)染效率很理想，但是其有潛在的細(xì)胞毒性、免疫原性以及炎癥反應(yīng)使得其應(yīng)用受到很大的限制[9]。非病毒載體包括多種載體方式給藥，納米粒載體是由生物材料制備的非病毒載體，粒徑大小在 1～1000 nm。納米粒在遞送siRNA方面具有很多優(yōu)點(diǎn)，比如提高siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，具有靶向功能，降低細(xì)胞毒性和免疫原性，增加細(xì)胞攝取和內(nèi)化行為等，這些都有利于提高siRNA的基因沉默效率。此外，通過(guò)對(duì)已形成納米粒遞送系統(tǒng)的修飾，可進(jìn)一步提高納米粒在體內(nèi)遞送的穩(wěn)定性，增加細(xì)胞的靶向功能以及促進(jìn)siRNA在細(xì)胞質(zhì)的釋放等。非病毒納米載體材料主要包括：聚合物材料、脂質(zhì)材料和蛋白多肽類(lèi)材料[10]。現(xiàn)分別就各類(lèi)材料中的具體載體物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特征作如下介紹。

1 高分子聚合物材料介導(dǎo)的siRNA給藥系統(tǒng)

由于siRNA荷負(fù)電，荷正電的陽(yáng)離子聚合物可以與之以靜電結(jié)合力相組裝，從而完成siRNA的包載。聚合物載體材料又可分為合成高分子聚合物與天然高分子聚合物。

1.1 合成高分子聚合物 該類(lèi)化合物主要包括聚乙烯亞胺(polyethylenim ine，PEI)及其修飾物、聚丙交酯乙交酯(polylactide-co-glycolide，PLGA)、以及聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子(polyam idoam ine dendrimei，PAMAM)。

PEI及其修飾物分為分枝狀和線(xiàn)狀兩種類(lèi)型，相對(duì)分子質(zhì)量為1×103至1×106，分枝狀的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于線(xiàn)狀[11]。PEI作為siRNA轉(zhuǎn)染載體的機(jī)制為：PEI分子中大量的質(zhì)子化氨基基團(tuán)可以與 siRNA 形成非共價(jià)的高電解質(zhì)分子復(fù)合物，被細(xì)胞內(nèi)吞后，通過(guò)獨(dú)特的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，增強(qiáng)質(zhì)子和水的內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)涵體破裂釋放出 siRNA 到胞漿[12,13]。但是PEI因其較高的分子量和較大的使用劑量而具有一定的毒性，通過(guò)對(duì)PEI結(jié)構(gòu)的修飾來(lái)達(dá)到保持基因遞送效率和降低毒性的平衡是目前研究的熱點(diǎn)。通過(guò)偶聯(lián)親水性基團(tuán)到PEI的結(jié)構(gòu)上是一種解決PEI毒性問(wèn)題的可行方法。但是耦合親水性基團(tuán)之后仍要能保持PEI一定的正電荷密度以達(dá)到穩(wěn)定結(jié)合siRNA的能力。Oskuee 等人通過(guò)對(duì)PEI的羧基化來(lái)提高它的親水性和中和PEI表面的一部分正電荷，修飾之后的PEI在沒(méi)有降低它的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)的前提下減少了毒性，提高了基因沉默效率[14]。Schiffelers等人將RGD環(huán)狀三肽作為靶頭修飾到PEG化的PEI表面，制備了靶向siRNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。結(jié)果表明該載體的靶向性能提高了，并且粒子半徑減小至70～100 nm，穩(wěn)定性增加[15]。

PLGA是乳酸和乙醇酸通過(guò)酯鍵連接的共聚物，在體內(nèi)代謝的最終產(chǎn)物為二氧化碳和水，是一類(lèi)無(wú)毒、生物可降解、生物相容性好的高分子材料。其包裹的siRNA被釋放到細(xì)胞之中。執(zhí)行相應(yīng)的功能。研究表明影響PLGA納米粒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的因素主要有溶液pH、納米粒與siRNA的比例等[16]。采用噴霧干燥技術(shù)制備的PLGA納米球作為siRNA載體，可減小聚集并提高轉(zhuǎn)染率[17]。近年來(lái)PLGA的修飾物大有發(fā)展。使用聚乙二醇-PLGA作為載體進(jìn)行siRNA的體外運(yùn)送試驗(yàn)結(jié)果顯示：聚乙二醇化的PLGA載體材料可以增加其轉(zhuǎn)染效率[18]。

樹(shù)枝狀大分子是有規(guī)律地高分散性排列的結(jié)構(gòu)大分子，而且其結(jié)構(gòu)形狀、分子量大小和表面所帶電荷均可以調(diào)整。這些特殊的結(jié)構(gòu)使得樹(shù)枝狀大分子能夠通過(guò)內(nèi)部封裝、表面吸附和化學(xué)偶聯(lián)來(lái)裝載藥物。PAMAM近年來(lái)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因藥物治療的載體研究。但在siRNA遞送方面的研究還具有很大的潛力。PAM AM的化學(xué)結(jié)構(gòu)表面上有伯胺基，內(nèi)部有叔胺基。伯胺基可以與核酸分子結(jié)合，有效壓縮核酸分子的粒徑在納米級(jí)范圍內(nèi)以促進(jìn)細(xì)胞的攝取。而叔胺基則可以在核內(nèi)體中引起“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，從而促進(jìn)核酸分子從核內(nèi)體中的逃逸和在細(xì)胞質(zhì)中的釋放。

此外，樹(shù)枝狀高分子聚合物聚丙酰胺在遞送siRNA方面也有研究，但是相對(duì)較少。Taratula研究發(fā)現(xiàn)，聚丙酰胺的代數(shù)越高，在與siRNA形成離散型納米粒的程度就越好。但是隨著代數(shù)的增加，粒徑和表面電荷也隨之增加，聚丙酰胺的毒性也不斷增加[19]。

1.2 天然高分子聚合物 該類(lèi)化合物由于其廣泛的來(lái)源性以及良好的生物相容性，在siRNA傳遞方面?zhèn)涫荜P(guān)注。主要包括：殼聚糖、環(huán)糊精以及膠原蛋白。

殼聚糖是由殼多糖去乙酰化衍生而來(lái)的一類(lèi)天然高分子多糖，主要存在甲殼動(dòng)物和昆蟲(chóng)殼上。殼聚糖因其具有低毒性、低免疫原性以及出色的生物降解性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，已成為構(gòu)成siRNA遞送載體的常用材料。帶正電荷的殼聚糖能夠通過(guò)電荷作用力與帶負(fù)電的DNA和siRNA絡(luò)合形成基因遞送系統(tǒng)。

為了提高殼聚糖載體遞送s i R N A的效率，Opanasopit將殼聚糖分別與谷氨酸、醋酸和鹽酸反應(yīng)生成殼聚糖鹽，然后再與siRNA通過(guò)靜電相互作用形成遞送系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，影響殼聚糖/siRNA復(fù)合物形成的主要因素是殼聚糖的分子量以及殼聚糖與酸二者之間的質(zhì)量比。低的殼聚糖分子量(20 kDa)和高的質(zhì)量比形成的殼聚糖/siRNA具有高的基因沉默效率。他們還利用羥基苯并三唑與殼聚糖成鹽后與siRNA結(jié)合形成復(fù)合物，在殼聚糖分子量為20 kDa，質(zhì)量比高達(dá)80時(shí)，基因沉默效率能達(dá)到60%[20]。利用硫胺素焦磷酸的磷酸基團(tuán)與殼聚糖上的氨基反應(yīng)成鹽后不但可以提高殼聚糖本身的水溶性，硫胺素焦磷酸上的氨基具有優(yōu)越的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，這些性質(zhì)可以大大提高siRNA在體內(nèi)的基因沉默效率[21]。有研究顯示：利用維生素E的琥珀酸鹽與不同分子量的寡聚殼聚糖進(jìn)行偶聯(lián)得到兩親性的α-生育酚-寡聚殼聚糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在寡聚殼聚糖的分子量為4 kDa時(shí)得到的siRNA遞送載體能夠顯著提高siRNA的細(xì)胞攝取(＞98%)和沉默效率[22]。另有文獻(xiàn)表明，經(jīng)過(guò)RGD修飾的殼聚糖/siRNA遞送系統(tǒng)能夠高效和有選擇地輸送到腫瘤細(xì)胞[23]。

環(huán)糊精具有外緣親水而內(nèi)腔疏水的獨(dú)特的幾何結(jié)構(gòu)特征，因而在包載疏水性藥物方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。盡管在遞送質(zhì)粒DNA有較多的研究，但是有關(guān)用它遞送siRNA的研究并不多。Dav is研究合成了一種新型遞送系統(tǒng)-環(huán)糊精聚合物，利用聚合物所帶的正電荷與siRNA通過(guò)電荷相互作用自組裝形成納米粒，能成功地將siRNA遞送到靶細(xì)胞中[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用這種新型的基因遞送載體遞送siRNA能夠顯著抑制小鼠轉(zhuǎn)移尤文氏肉瘤的生長(zhǎng)速度。

膠原蛋白是一類(lèi)天然高分子物質(zhì)，具有生物可降解以及良好的生物相容性， Takeshita等人通過(guò)將等體積的膠原蛋白與siRNA溶液相混合，制備了一種siRNA/膠原蛋白復(fù)合物[25]，體外試驗(yàn)測(cè)定其具有長(zhǎng)循環(huán)特性和癌組織蓄積性，并且無(wú)免疫原性。但是相關(guān)研究還是比較少的。

2 脂質(zhì)材料介導(dǎo)的siRNA輸送系統(tǒng)

脂質(zhì)體是由磷脂、膽固醇等膜材包合而成，具有類(lèi)似生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子層囊泡。用于包載siRNA的主要為中性脂質(zhì)體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體。中性脂質(zhì)體可用于體外siRNA的遞送。其脂質(zhì)材料包括：二油酰磷脂酰膽堿等。但是中性脂質(zhì)材料由于其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并不常單獨(dú)用于siRNA的遞送，而是較多地與陽(yáng)離子脂質(zhì)體聯(lián)合應(yīng)用。用于siRNA遞送的脂質(zhì)體多為陽(yáng)離子脂質(zhì)體，常用的陽(yáng)離子磷脂有1，2-二油?；?3-三甲基氨基內(nèi)烷、N-[1-(2，3-二油酰)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨、二油?；字Ｒ掖及?、膽固醇等。M o rrissey采用陽(yáng)離子脂質(zhì)、致融類(lèi)脂和聚乙二醇化的磷脂形成磷脂雙分子層，把兩種siRNA分子，HBV263和HBV1583，依靠電荷相互作用包載進(jìn)水溶性中心之后，形成了一種穩(wěn)定的脂質(zhì)體。它不僅可以促進(jìn)細(xì)胞攝取和核內(nèi)體逃逸，而且大大增加在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的時(shí)間，提高了siRNA對(duì)肝炎病毒的干擾作用[26]。但是，由于陽(yáng)離子脂質(zhì)材料的細(xì)胞毒作用，其應(yīng)用還是很有限。但是隨著材料的不斷進(jìn)步，二油酰基磷脂酰乙醇胺等已經(jīng)比1，2-二油?；?3-三甲基氨基內(nèi)烷的毒性小了很多，可用于體內(nèi)外的試驗(yàn)當(dāng)中。

3 多肽類(lèi)介導(dǎo)的siRNA遞送系統(tǒng)

因?yàn)槎嚯牡牡投拘裕３Ｓ脕?lái)作為核酸的運(yùn)送載體材料。但是，相對(duì)于其他陽(yáng)離子材料來(lái)說(shuō)，它不能有效地壓縮核酸以及在細(xì)胞質(zhì)中釋放核酸，因此在用作核酸的載體材料時(shí)研究人員會(huì)選擇性對(duì)其加以修飾。聚天冬氨酸二乙基色胺(聚天冬氨酸的一種衍生物)具有PH敏感的裂解核內(nèi)體作用[27]。它能裂解細(xì)胞膜可能是因?yàn)樵诤藘?nèi)體的PH條件下，它分子中的1,2-二氨基乙烷能形成雙質(zhì)子，從而具有“質(zhì)子海綿”效應(yīng)。因此可以在不引起細(xì)胞毒性的情況下，高效的對(duì)核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

4 新材料的構(gòu)想設(shè)計(jì)

基于上述幾類(lèi)siRNA的非病毒納米載體的介紹，不難發(fā)現(xiàn)其中各有優(yōu)劣，因此將其聯(lián)合應(yīng)用或者進(jìn)行新材料設(shè)計(jì)是勢(shì)在必行的。根據(jù)siRNA荷負(fù)電以及易于被核酸酶水解的特性，制備成納米材料將其包被在內(nèi)部可以增加其穩(wěn)定性。Yelena Vachutinsky等人曾設(shè)計(jì)了一種聚合物膠束用于靶向新生血管的質(zhì)粒DNA的傳遞[28]，在其基礎(chǔ)上構(gòu)想了一種新的siRNA的載體材料。將聚乙二醇與巰基化的殼聚糖形成嵌段共聚體，經(jīng)過(guò)二硫鍵的固化交聯(lián)形成嵌段共聚物納米粒，其中聚乙二醇為親水性，位于膠束外側(cè)，而殼聚糖部分含有多個(gè)荷正電氨基，位于膠束內(nèi)核處，并與siRNA通過(guò)靜電結(jié)合作用結(jié)合，將其包裹于內(nèi)部?，F(xiàn)以靶向腫瘤新生血管的siRNA的遞送系統(tǒng)為例加以說(shuō)明。

RGD為整合素受體αv家族的一個(gè)識(shí)別模塊，將其修飾于該聚合物膠束外側(cè)，可完成對(duì)新生血管的靶向作用[29,30]。參考Yelena Vachutinsky等人制備二硫鍵交聯(lián)的嵌段共聚物膠束，二硫鍵的作用可以提高該膠束在細(xì)胞外的穩(wěn)定性，故將殼聚糖巰基化，并與聚乙二醇相接構(gòu)成嵌段共聚物。經(jīng)固化交聯(lián)作用形成穩(wěn)定的膠束。由于聚乙二醇與殼聚糖具有良好的生物相容性與生物可降解性，而RGD具有良好的新生血管靶向性，推測(cè)該結(jié)構(gòu)將會(huì)成為一個(gè)比較理想的siRNA的傳遞系統(tǒng)。

5 小結(jié)與展望

從發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA在線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)可以干擾特定基因的表達(dá)，RNA干擾現(xiàn)象就引起了全球關(guān)注，siRNA作為疾病治療藥物的前景逐漸被醫(yī)藥學(xué)工作者認(rèn)識(shí)。為了有效遞送siRNA到內(nèi)體發(fā)揮基因沉默效應(yīng)，種類(lèi)多樣的非病毒載體的研究得到了快速發(fā)展。但是要使siRNA治療在臨床上得到成功應(yīng)用，siRNA的遞送仍然是橫亙?cè)趯?shí)驗(yàn)室研究與臨床應(yīng)用之間的壁壘。因此，研究和開(kāi)發(fā)安全有效的遞送材料和遞送系統(tǒng)將是基因治療研究的熱點(diǎn)。

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