人乳鐵蛋白對關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖和細胞外蛋白激酶表達的作用

王卒平，劉啟蒙，張冬青，況 勇

（重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校 404100）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoart hritis，OA）是一種常見的老年外科疾病，其主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟組織的變性、破壞以及骨質(zhì)增生，常引起老年患者關(guān)節(jié)疼痛，嚴(yán)重時影響其日常行動，使老年患者的生命質(zhì)量嚴(yán)重下降。OA在臨床上的治療目前仍是一個難題，一般患者病情發(fā)展到終末期需行關(guān)節(jié)置換術(shù)，手術(shù)的創(chuàng)傷和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)常給患者及其家庭帶來巨大壓力［1］。而除了手術(shù)之外更加行之有效的藥物治療尚不明確，本文通過探討人乳鐵蛋白（h LF）在OA軟骨細胞外蛋白激酶（ERK）表達與促進細胞增殖和活力中的作用，旨在為臨床治療OA，尤其是早期藥物治療提供新的治療方向，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 8例OA患者，其中男6例，女2例，年齡55～65歲，平均（59．79±7．91）歲。所有患者均經(jīng)過重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校相關(guān)實習(xí)醫(yī)院骨外科的相關(guān)檢查和診斷，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會骨科分會《骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2007年版）》明確診斷為OA［2］。所有患者均在本院行關(guān)節(jié)置換術(shù)，將軟骨組織取下，置入脫酶處理的EP管，液氮轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。選取患者的軟骨組織進行人關(guān)節(jié)軟骨細胞分離和體外培養(yǎng)。上述試驗經(jīng)過醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。試驗所用材料如下：h LF（英國Sig ma公司生產(chǎn)），Ⅱ型膠原酶（英國Paisley公司生產(chǎn)），胎牛血清（FBS）（英國Biowest公司生產(chǎn)），LIVE／DEAD試劑盒（荷蘭Molecular Probes公司生產(chǎn)），All Prep DNA／RNA／Protein試劑盒（英國Qiagen Lld公司生產(chǎn)），DNA轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)），i Cycler（英國Bio-Rad Labora-tories Ltd公司生產(chǎn)），噻唑藍（MTT）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）均由美國Cambrex Bioseience公司生產(chǎn)，ERK、磷酸化ERK抗體和熒光標(biāo)記二抗均由英國R＆D公司生產(chǎn)。

1．2 方法 取直徑為1 mm，厚度為1 mm的人關(guān)節(jié)軟骨組織，用Ⅱ型膠原酶進行消化，濃度為300 U／mL，于37℃水浴中震蕩（75 r／min），消化時間為16 h。取胰蛋白酶與EDTA液配制而成的消化液加入FBS培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，至原代細胞生長超過瓶底80%時，加入胰蛋白酶消化液，傳代培養(yǎng)，取第2代體外培養(yǎng)細胞進行試驗。將體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)液接種于96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h后分別加入12．5、25．0、50．0、100．0、200．0 mg／L的h LF。并設(shè)置空白對照組，即h LF濃度為0。每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)后離心取細胞液用MTT法檢測關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖力，用LIVE／DEAD染色檢測h LF對關(guān)節(jié)軟骨細胞活力的影響，用實時定量PCR（RT-PCR）檢測ERK mRNA的表達［3］。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS15．0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，多個樣本之間的比較采用One-Way ANOVA方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

通過MTT法檢測關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖力，結(jié)果顯示h LF對人關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖力具有促進作用，且具有顯著的濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），見表1。用LIVE／DEAD染色檢測關(guān)節(jié)軟骨細胞的活力，結(jié)果顯示h LF對人關(guān)節(jié)軟骨細胞的活力具有促進作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），見表2、圖1。通過RT-PCR檢測ERK mRNA的表達，結(jié)果顯示h LF能增加人關(guān)節(jié)軟骨細胞的ERK mRNA的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），見表3。

表1 h LF對人關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖力的影響

表2 h LF對人關(guān)節(jié)軟骨細胞活力的影響（±s，%）

組別 樣本例數(shù) 關(guān)節(jié)軟骨細胞存活細胞比率對照組16 83．71±5．73試驗組16 99．52±3．85

圖1 h LF對關(guān)節(jié)軟骨細胞活力的促進作用（LIVE／DEAD染色×20）

表3 h LF對人關(guān)節(jié)軟骨細胞的ERK mRNA 表達影響（±s）

表3 h LF對人關(guān)節(jié)軟骨細胞的ERK mRNA 表達影響（±s）

組別 樣本例數(shù) ERK mRNA 相對表達量對照組16 1．013±0．021試驗組16 1．764±0．123

3 討 論

OA是一種常見的老年慢性骨科疾病，其具體的發(fā)病機制尚未闡明清楚，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟組織的變性、破壞及骨質(zhì)增生等病理性改變，是引發(fā)老年人關(guān)節(jié)疼痛的常見原因之一，嚴(yán)重時可影響其日常行動，降低老年患者的生存質(zhì)量［4］。一般患者病情發(fā)展到終末期導(dǎo)致患者行動受限，則需行關(guān)節(jié)置換術(shù)，而早期積極的藥物治療研究仍未取得重大的進展和突破［5］。OA是一個復(fù)雜的發(fā)病過程，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為軟骨基質(zhì)的合成和降解失衡造成軟骨細胞肥大變化、終末分化直至礦化等變化過程，軟骨細胞合成分泌的蛋白多糖和膠原類型也隨之發(fā)生改變，同時產(chǎn)生一定的增殖能力，進而導(dǎo)致OA發(fā)病［6］。但近年研究顯示：絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）-ERK1／2信號通路在OA軟骨細胞中的表達水平明顯上調(diào)，且在軟骨組織中也存在顯著上調(diào)趨勢，表明ERK1／2在調(diào)控OA軟骨細胞病理改變中起到重要作用［7］。而MAPK在關(guān)節(jié)軟骨的退變和OA的病程中發(fā)揮了重要作用，其磷酸化可能是軟骨細胞受到刺激后的早期事件［8］。因此調(diào)節(jié)人類關(guān)節(jié)軟骨退變中的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對OA的治療具有重要意義。

軟骨細胞是軟骨組織中惟一的細胞，在合成和分解膠原、蛋白聚糖等細胞外基質(zhì)中以及維持軟骨組織相關(guān)功能方面具有重要的作用［9］。經(jīng)過相關(guān)的病理檢查可以發(fā)現(xiàn)，OA患者的軟骨細胞發(fā)生了一系列的病理改變，包括肥大、增生、礦化等，使其正常的生理功能也發(fā)生了改變，導(dǎo)致軟骨增生，引發(fā)病變［10］。而h LF是一種天然的具有免疫功能的多功能蛋白質(zhì)，其主要生理功能包括抗氧化、抗感染、抗癌等調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能［11］。近些年的研究顯示h LF還表現(xiàn)出調(diào)控細胞增殖的功能，所以本文以此為線索，展開h LF對人關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖力及活力影響的探究［12］。

本試驗表明，（1）h LF對人關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖力具有促進作用，且具有顯著的濃度依賴性，說明h LF通過顯著促進關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖力，可能在OA患者軟骨的修復(fù)中起到重要作用。（2）h LF對關(guān)節(jié)軟骨細胞的活力具有促進作用。（3）h LF能增加關(guān)節(jié)軟骨細胞的ERK mRNA的表達，已知ERK屬于MAPK家族中的一個亞族，由ERK1和ERK2兩種異構(gòu)體組成，在軟骨細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、分化中有重要作用，可以促進軟骨細胞中Ⅱ型膠原、整合素β1和軟骨蛋白多糖的表達。本文研究提示h LF可能通過上調(diào)ERK基因表達而促進關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖，進而在OA的治療中起到重要作用。

綜上所述，h LF能夠上調(diào)ERK mRNA的表達，促進關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖力與活力。臨床上可以此為線索進一步研究OA的發(fā)病機制，尋找更有效的治療方法。

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