富氫生理鹽水對(duì)大鼠重度顱腦損傷后氧化應(yīng)激保護(hù)作用的研究

徐其嶺，閆 莉

（1．鄭州人民醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州450000；2．河南省人民醫(yī)院CT室，鄭州450000）

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是對(duì)腦組織的一種物理性損傷，可引起暫時(shí)性或永久性腦功能損傷，繼發(fā)性的腦損傷被認(rèn)為是患者病情加重的重要因素［1］。盡管一系列的醫(yī)療干預(yù)措施如采用高壓氧治療、亞低溫以及早期康復(fù)治療在很大程度上能降低顱腦損傷的病死率，改善預(yù)后，提高生存質(zhì)量。但目前仍然沒(méi)有行之有效的治療TBI的神經(jīng)保護(hù)藥物［2］。研究表明TBI后，壞死神經(jīng)組織產(chǎn)生的炎性反應(yīng)，如氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧自由基對(duì)腦組織具有損害作用，并在繼發(fā)性腦組織損傷和功能恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。富氫生理鹽水（HS）是一種優(yōu)質(zhì)的選擇性抗氧化劑，其在臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的研究主要集中于對(duì)缺血再灌注引起的肺臟、腸及腦損傷的保護(hù)作用。目前關(guān)于HS對(duì)重度顱腦損傷（severe trau matic brain injury，STBI）引起的機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的影響作用尚不明了，本研究通過(guò)建立STBI大鼠模型，給予HS治療，檢測(cè)大鼠血漿中丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）活性，探討HS對(duì)TBI大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激水平的影響作用。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物選擇 健康的雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，動(dòng)物均在相同條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。

1．2 大鼠STBI模型的建立 根據(jù)參考文獻(xiàn)資料，采用控制性皮質(zhì)撞擊損傷進(jìn)行大鼠STBI模型的建立［3-4］。將大鼠用40 mg／kg戊巴比妥鈉麻醉后固定于立體定向儀上。用硫化物脫毛劑除去大鼠頭頂部被毛，頂部皮膚用碘伏消毒后切開(kāi)，分離暴露顱骨。采用高速鉆機(jī)行6 mm顱骨切除術(shù)。致傷點(diǎn)選擇介于人字縫和前囪縫合線的右側(cè)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)，用帶有尖端直徑5 mm的氣動(dòng)活塞撞擊器裝置以4．0 m／s的速度撞擊腦部達(dá)到3．0 mm深度，并置于腦部120 min建立STBI模型。手術(shù)后，用骨蠟進(jìn)行密封并縫合皮膚。假手術(shù)組僅進(jìn)行顱骨開(kāi)窗，不做打擊致傷。

1．3 HS的制備 HS的制備參考文獻(xiàn)［5-6］進(jìn)行。將袋裝250 mL醫(yī)用生理鹽水抽出50 mL，加入50 mL純凈的氫氣（購(gòu)自上?；繕?biāo)準(zhǔn)氣體有限公司，純度為100%）并充分混合。將含氫的生理鹽水置于0．4 MPa壓力下穩(wěn)壓12～24 h，達(dá)到飽和狀態(tài)，制備HS，使氫氣濃度保持在0．6 mmol／L左右，經(jīng)r輻射消毒滅菌后裝于鋁袋中常壓4℃保存。HS的濃度采用氣相色譜法進(jìn)行檢測(cè)［7］。HS需要每周新鮮配制保證氫的濃度不低于0．6 mmol／L。

1．4 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方案 將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、STBI＋生理鹽水（NS）組和STBI＋HS組，每組20只。STBI＋NS組在STBI手術(shù)后5 min內(nèi)經(jīng)腹腔注射NS 10 mL／kg，STBI＋HS組在STBI術(shù)后5 min內(nèi)經(jīng)腹腔注射HS 10 mL／kg。3組動(dòng)物分別于STBI術(shù)前和術(shù)后12、24、48 h檢測(cè)血漿中MAD水平以及SOD和GSH-PX的活性。

1．5 指標(biāo)檢測(cè)

1．5．1 血漿樣本中MDA水平的檢測(cè) 依據(jù)硫代巴比妥酸比色法進(jìn)行。按南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明操作。其中樣品中MDA含量＝（測(cè)定管吸光度-測(cè)定空白管吸光度）／（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度）×10 mmol／L×樣本稀釋倍數(shù)。

1．5．2 血漿樣本中SOD活性的檢測(cè) 依據(jù)黃嘌呤氧化酶法進(jìn)行。按南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明操作。樣品中SOD活性＝（對(duì)照管吸光度-測(cè)定管吸光度）×稀釋倍數(shù)／對(duì)照管吸光度×1／2。

1．5．3 血漿樣本中GSH-PX活性的檢測(cè) 依據(jù)5，5′-二硫代-雙-硝基苯甲酸顯色法。按南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明操作。GSH-PX活性＝（對(duì)照管吸光度-測(cè)定管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×樣本稀釋倍數(shù)。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0．05說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 血漿中MAD水平 與同組術(shù)前相比，STBI＋NS組及STBI＋HS組的MDA水平在術(shù)后24 h和48 h明顯升高（P＜0．05）。與假手術(shù)組比較，STBI＋NS組及STBI＋HS組動(dòng)物血漿中MDA水平在術(shù)后24 h和48 h均明顯升高（P＜0．05）。與STBI＋NS組相比，STBI＋HS組的MDA水平在術(shù)后24 h和48 h明顯降低（P＜0．05）。見(jiàn)表1。

2．2 血漿中SOD活性 與同組術(shù)前相比，STBI＋NS組及STBI＋HS組的SOD活性在術(shù)后12 h有所增高（P＜0．05），但在24 h和48 h明顯降低（P＜0．05）。與假手術(shù)組比較，STBI＋NS組及STBI＋HS組動(dòng)物血漿中SOD活性在術(shù)后24 h和48 h均明顯降低（P＜0．05）。與STBI＋NS組相比，STBI＋HS組的SOD活性在術(shù)后24 h和48 h明顯升高（P＜0．05）。見(jiàn)表2。

2．3 血漿中GSH-PX活性 與同組術(shù)前相比，STBI＋NS組及STBI＋HS組的GSH-PX活性在術(shù)后12 h有所增高（P＜0．05），但在24 h和48 h明顯降低（P＜0．05）。與假手術(shù)組比較，STBI＋NS組及STBI＋HS組動(dòng)物血漿中GSH-PX活性在術(shù)后24 h和48 h均明顯降低（P＜0．05）。與STBI＋NS組相比，STBI＋HS治療組的GSH-PX活性在術(shù)后24 h和48 h明顯升高（P＜0．05）。見(jiàn)表3。

表1 STBI術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中MDA水平比較（±s，n mol／mL）

表1 STBI術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中MDA水平比較（±s，n mol／mL）

a：P＜0．05，與同組術(shù)前比較；b：P＜0．05，與假手術(shù)組比較；c：P＜0．05，與STBI＋NS組比較。

組別 n 術(shù)前 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h假手術(shù)組20 3．21±0．13 3．56±0．09 3．68±0．08 3．79±0．14 STBI＋NS組 20 3．45±0．16 3．72±0．09 8．25±0．11 ab 18．69±0．05 ab STBI＋HS組 20 3．34±0．06 3．64±0．12 4．71±0．13abc 5．68±0．16 abc

表2 STBI術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中SOD活性比較（±s，U／mL）

表2 STBI術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中SOD活性比較（±s，U／mL）

a：P＜0．05，與同組術(shù)前比較；b：P＜0．05，與假手術(shù)組比較；c：P＜0．05，與STBI＋NS組比較。

組別 n 術(shù)前 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h假手術(shù)組 20 132．61±8．92 135．79±0．02 131．86±8．92 137．13±13．42 STBI＋NS組 20 138．27±6．13 145．63±11．21a 109．12±7．62 ab 92．37±10．61 ab STBI＋HS組 20 135．42±9．21 156．25±5．46 a 121．59±10．13 abc 110．28±9．89 abc

表3 STBI術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中GSH-PX活性比較（±s，U／mL）

表3 STBI術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中GSH-PX活性比較（±s，U／mL）

a：P＜0．05，與同組術(shù)前比較；b：P＜0．05，與假手術(shù)組比較；c：P＜0．05，與STBI＋NS組比較。

組別 n 術(shù)前 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h假手術(shù)組20 0．52±0．01 0．54±0．05 0．53±0．06 0．51±0．03 STBI＋NS組 20 0．48±0．02 0．55±0．04a 0．42±0．03 a 0．39±0．01 a STBI＋HS組 20 0．53±0．03 0．58±0．01 a 0．48±0．02 ab 0．44±0．05 abc

3 討 論

氧化應(yīng)激是由于各種內(nèi)外因素的刺激引起機(jī)體組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的氧自由基生成的增多和（或）清除能力降低，從而導(dǎo)致氧自由基在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積，體內(nèi)過(guò)多的氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化，造成細(xì)胞或組織氧化損傷，從而引起細(xì)胞損傷或凋亡，加劇機(jī)體的炎性反應(yīng)［8-9］。MDA是氧自由基攻擊細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸后生成的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其作為強(qiáng)交聯(lián)劑，與蛋白質(zhì)、核酸或脂類結(jié)成難溶性物質(zhì)，使生物膜通透性降低，繼而引起細(xì)胞破裂和（或）死亡，MDA水平的變化間接反映體內(nèi)脂質(zhì)氧化及組織損傷程度且性質(zhì)較穩(wěn)定。機(jī)體的抗氧化能力取決于脂質(zhì)過(guò)氧化程度和抗氧化保護(hù)的動(dòng)態(tài)平衡，目前研究認(rèn)為SOD、GSH-PX是機(jī)體中重要的抗氧化物酶。其中，SOD在機(jī)體的氧化與抗氧化平衡中起著關(guān)鍵作用，主要通過(guò)清除人體中超氧化物和H2O2，保護(hù)細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。谷胱甘肽是一種低分子自由基清除劑，可直接或間接清除H2O2、·OH等，是外源性和內(nèi)源性的抗氧化劑。當(dāng)機(jī)體血漿中出現(xiàn)MDA含量升高，SOD、GSH-PX下降，一般認(rèn)為機(jī)體出現(xiàn)損傷，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生了氧化性應(yīng)激。

目前關(guān)于氫氣抗氧化作用的研究日益成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)［10］。氫是無(wú)色、無(wú)嗅、無(wú)味具有低還原性的雙原子氣體。而近年相關(guān)的研究認(rèn)為，氫氣不是生理性惰性氣體，而是一種理想的抗氧化物質(zhì)，具有選擇性抗氧化作用，可特異性中和細(xì)胞內(nèi)有害自由基，保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)等不被破壞，維持線粒體正常功能，阻止細(xì)胞凋亡［11-13］。HS是將氫氣通過(guò)高壓溶解于生理鹽水中，關(guān)于氫氣對(duì)機(jī)體各種外源性因素引起的氧化應(yīng)激的影響作用存在不一致的研究結(jié)果［14］。任漢強(qiáng)等［11］的研究結(jié)果表明，HS對(duì)高糖所致內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，可有效降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和抗氧化酶減少，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射HS可以顯著提高大鼠腹部臟器如肝、腎等組織內(nèi)的氫濃度，并對(duì)腦、腸缺血再灌注損傷動(dòng)物模型都有較好的保護(hù)作用。Matchett等［15］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吸入2%氫氣后對(duì)中度及重度新生兒缺血缺氧腦病大鼠模型療效不明顯。但是Xie等［16］研究表明，2%氫氣吸入對(duì)嚴(yán)重膿毒血癥小鼠具有保護(hù)作用。Ji等［17］研究表明，吸入氫氣可通過(guò)降低腦組織中氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生及提高抗氧化酶活性對(duì)TBI大鼠具有顯著保護(hù)作用。

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，TBI后機(jī)體的氧自由基反應(yīng)增強(qiáng)。腦組織在生理情況下清除自由基主要依靠?jī)深愇镔|(zhì)，酶和天然的抗氧化劑。自由基的生成和清除之間保持動(dòng)態(tài)平衡，以維持機(jī)體功能的正常和結(jié)構(gòu)完整，但在某種病理情況下，自由基的生成超出機(jī)體清除能力時(shí)會(huì)造成機(jī)體的組織損傷。由于腦組織脂質(zhì)豐富，抗氧化能力較弱，因此極易受到自由基的攻擊而發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。控制性皮質(zhì)撞擊損傷模型作為復(fù)制局部TBI的成熟模型廣泛用于小鼠和大鼠前后腦組織中細(xì)胞和分子改變的研究中。因此，本研究采用控制性皮質(zhì)撞擊損傷誘導(dǎo)的TBI模型，結(jié)果表明，STBI手術(shù)過(guò)程中存在一定程度的氧化應(yīng)激損傷。與術(shù)前相比，STBI手術(shù)組動(dòng)物血中MDA水平在顱腦損傷24 h和48 h后顯著升高；與術(shù)前相比，STBI手術(shù)組動(dòng)物血中的SOD及GSH-PX的活性在顱腦損傷后12 h有所升高，但在STBI 24 h和48 h后顯著降低，提示STBI手術(shù)過(guò)程中機(jī)體受到刺激，生成大量氧自由基，引起了機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化，發(fā)生了氧化性應(yīng)激。與STBI＋NS組相比，STBI＋HS治療可以顯著降低STBI傷后MDA的水平，增加STBI術(shù)后SOD及GSH-PX的活性。

綜上所述，在大鼠STBI模型中，HS治療可有效降低神經(jīng)損傷引起的機(jī)體氧化產(chǎn)物的生成和抗氧化酶的減少，對(duì)氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。采用新的抗氧化劑HS治療可能成為治療TBI更有效的治療策略。

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