基于廣泛靶向代謝組學(xué)分析花櫚木不同部位揮發(fā)性代謝物差異

夏詩(shī)琪,周成釧,郭昌慶,王 甜,邵齊飛,賴(lài)建斌,劉麗婷*,歐陽(yáng)天林*

1江西省林業(yè)科學(xué)院,南昌 330013;2江西省林業(yè)科技實(shí)驗(yàn)中心,贛州 341600

花櫚木(Ormosiahenryi)為豆科紅豆屬常綠喬木,主要分布在我國(guó)亞熱帶區(qū)域,以江西、浙江、安徽、湖北、湖南、廣東、四川、貴州和云南等省份為主[1]。由于其種子結(jié)實(shí)率低、自然更新能力差,加上人為破壞,導(dǎo)致野生資源枯竭,處于瀕危狀態(tài),被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[2]?；澳緲?shù)形高大、木材紋理美觀、紅色種子可做工藝品;花櫚木全株均可入藥,具有活血化瘀,祛風(fēng)消腫功效[3]?！度珖?guó)中草藥匯編》里記載花櫚木“根皮外用治骨折,葉外用治燒燙傷”。在民間,花櫚木常做成床板,具有安神的效果。因此,花櫚木是集材用、景觀和藥用為一體的特色珍貴樹(shù)種。

植物的揮發(fā)性物質(zhì)可以通過(guò)人體皮膚和呼吸系統(tǒng)作用于人體,具有穩(wěn)定人體中樞神經(jīng)、調(diào)節(jié)情緒、提高免疫力、有效減少微生物與病毒對(duì)人體傷害的作用[4]。現(xiàn)代研究表明花櫚木中主要含有醛酮類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)、烯烴類(lèi)、胺類(lèi)、環(huán)烴類(lèi)、羧酸類(lèi)以及酰胺類(lèi)等89個(gè)揮發(fā)性成分,其中有益成分有β-石竹烯、檸檬烯、β-紫羅蘭酮等,在森林康養(yǎng)、醫(yī)藥日化產(chǎn)品等領(lǐng)域具有較高的利用價(jià)值[5]。此外,研究發(fā)現(xiàn),花櫚木提取物能作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),Lu[6]等第一次提出花櫚木葉提取物有初步的抗抑郁作用;Zhu[7]通過(guò)采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激小鼠模型研究花櫚木葉提取物對(duì)抗抑郁治療的研究,發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗抑郁作用。

植物揮發(fā)性成分的含量組成與組織部位密切相關(guān),Tao等[8]對(duì)木蝴蝶不同部位的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)均含有較多醇類(lèi)物質(zhì),且每個(gè)部位都存在高于其他部位的特征物質(zhì);Guo等[9]研究發(fā)現(xiàn)金銀花的金花部位揮發(fā)性成分種類(lèi)多,乙酸、2-甲基丁醛或3-甲基丁醛是各部位的共性豐量成分。目前對(duì)于花櫚木根、枝、葉中代謝物組分的全面解析,以及3個(gè)部位間成分的差異還未見(jiàn)報(bào)道。大量的研究表明,植物揮發(fā)性之所以具有保健功效,這和釋放出的萜類(lèi)化合物濃度有密切關(guān)系,萜類(lèi)化合物也是花櫚木揮發(fā)性成分中的主要物質(zhì)[5]。因此,挖掘花櫚木中高度富集的揮發(fā)性成分,明確活性成分(以萜類(lèi)化合物為主)集中部位,對(duì)于花櫚木資源的開(kāi)發(fā)利用意義重大。

廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)能高精度、高通量、廣覆蓋檢測(cè)生物樣本中的代謝物及含量,通過(guò)高通量檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理,揭示生物樣本中代謝物的變化規(guī)律和對(duì)不同環(huán)境、時(shí)期及外界刺激的應(yīng)答,已廣泛應(yīng)用于植物非生物脅迫[10]、抗病性[11]、炮制[12]等方面。本研究擬利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù),鑒定并分析花櫚木根、枝、葉中的揮發(fā)性成分,研究其多樣性與富集特征,解析3個(gè)部位間顯著差異代謝物,為今后代謝途徑和基因?qū)用娴纳钊肫饰龅於ɑA(chǔ),為花櫚木資源利用部位的選擇和非木質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花櫚木為人工栽培,栽植于江西省信豐縣金盆山林場(chǎng)內(nèi)。于2022年5月,選取3株五年生、長(zhǎng)勢(shì)相近的同一種源的花櫚木植株(由江西省林業(yè)科學(xué)院珍貴樹(shù)種與森林提質(zhì)增效團(tuán)隊(duì)劉麗婷鑒定),采集根、枝、葉,編號(hào)分別為JPSG1～JPSG3、JPSJ1～JPSJ3、JPSY1～JPSY3。樣品采集后于陰涼處晾干,粉碎后過(guò)40目篩保存?zhèn)溆?標(biāo)本存放于江西省林業(yè)科學(xué)院珍貴樹(shù)種與森林提質(zhì)增效團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室。

GC-MS/MS 8890-7000D:色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),萃取頭120 μm DVB/CWR/PDMS,固相微萃取裝置SPME Arrow,老化裝置Fiber Conditioning Station,Agilent公司;正己烷(色譜純,默克化工技術(shù)(上海)有限公司)。

1.2 揮發(fā)油提取

分別稱(chēng)取500 g的花櫚木根、枝、葉,采取水蒸氣蒸餾法提取花櫚木揮發(fā)性成分,收集揮發(fā)油提取器上層揮發(fā)油。

1.3 GC-MS采集條件

稱(chēng)取5 mg揮發(fā)油樣品,加入500 μL正己烷,渦旋混合均勻,每個(gè)樣本移取100 μL于頂空瓶中,采用全自動(dòng)頂空固相微萃取進(jìn)行樣本萃取,以供GC-MS分析。

HS-SPME萃取條件:在60 ℃恒溫條件下,震蕩5 min,120 μm DVB/CWR/PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶,頂空萃取15 min,于250 ℃下解析5 min,然后進(jìn)行GC-MS分離鑒定。采樣前萃取頭在250 ℃下老化5 min。

色譜條件:載氣為高純氦氣(純度不小于99.999%),恒流流速1.2 mL/min,進(jìn)樣口溫度250 ℃,不分流進(jìn)樣,溶劑延遲3.5 min。程序升溫:40 ℃保持3.5 min,以10 ℃/min升至100 ℃,再以7 ℃/min升至180 ℃,最后以25 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230 ℃,四級(jí)桿溫度150 ℃,質(zhì)譜接口溫度280 ℃,電子能量70 eV,掃描方式為選擇離子檢測(cè)模式(SIM),定性定量離子精準(zhǔn)掃描。

取等體積的所有樣本代謝物混合制備成質(zhì)控樣本(quality control),以考察整個(gè)分析過(guò)程的重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基于邁維(武漢)生物技術(shù)有限公司MWDB數(shù)據(jù)庫(kù)(Metware database)和代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)分析。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后,利用Analyst 1.6.3和MassHunter軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù),包括峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和質(zhì)譜碎片歸屬分析等。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理,根據(jù)獲得的保留時(shí)間、質(zhì)核比及峰強(qiáng)進(jìn)行注釋,同時(shí)對(duì)大部分物質(zhì)使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)一步確認(rèn)。使用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析(cluster analysis)、主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)等。具體參照Z(yǔ)hang等[13]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 花櫚木中化合物的鑒定

為了更清楚地了解花櫚木不同部位揮發(fā)性代謝物的差異,通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定。從花櫚木根、枝、葉中共鑒定到589個(gè)揮發(fā)性成分,其中包括物質(zhì)二級(jí)分類(lèi)萜類(lèi)162個(gè)(順式-檸檬醛、香茅醛、(+)-檸檬烯、茅蒼術(shù)醇、β-紫羅蘭酮、α-蒎烯等)、酯98個(gè)(異丁酸肉桂酯、乙酸二甲基庚酯、丁酸香茅酯等)、雜環(huán)化合物78個(gè)(2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-己?；秽?、呋喃酮等)、烴類(lèi)51個(gè)(正十五烷、正十二烷等)、酮49個(gè)(二苯甲酮、覆盆子酮等)、醇43個(gè)(癸醇、1-辛醇等)、醛25個(gè)(可可醛、三聚乙醛等)、酸24個(gè)、芳烴23個(gè)、酚9個(gè)、胺7個(gè)、含硫化合物6個(gè)、含氮化合物6個(gè)、鹵代烴3個(gè)、醚1個(gè)、其他類(lèi)4個(gè)。

2.2 PCA主成分分析和聚類(lèi)熱圖分析

通過(guò)對(duì)樣本(包括質(zhì)控樣品)進(jìn)行主成分分析,以便初步了解各組樣本之間的總體代謝物差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。從圖1可以看出,第一主成分(PC1)可以解釋原始數(shù)據(jù)集的50.14%特征,從第一主成分上可以發(fā)現(xiàn),根與其他部位發(fā)生了分離,而枝和葉在第二主成分上發(fā)生了分離,該主成分解釋原始數(shù)據(jù)集的22.62%的特征?；澳静煌课坏臉颖灸軌虻玫捷^好的分離,說(shuō)明花櫚木不同部位的揮發(fā)性代謝物之間存在著差異。

圖1 各組樣品的PCA圖Fig.1 PCA map of each group of samples

不同部位中揮發(fā)性代謝物的積累模式差異可以通過(guò)聚類(lèi)熱圖(見(jiàn)圖2)進(jìn)行分析。聚類(lèi)熱圖分析的結(jié)果表明,在不同組別中物質(zhì)有明顯的差異,一共分為了4簇,簇1中的代謝物在根部最高;簇2中的揮發(fā)性代謝物在枝中最高,在根中最低;簇3中揮發(fā)性代謝物在枝和葉中較高;簇4中揮發(fā)性代謝物在葉中最高,在枝中最低。花櫚木在根、枝、葉中的揮發(fā)性代謝物有明顯差異,代謝物在枝和葉中累積較多。聚類(lèi)熱圖分析也能表明生物學(xué)重復(fù)之間良好同質(zhì)性和數(shù)據(jù)的高可靠性。

圖2 各組樣品的聚類(lèi)熱圖Fig.2 Cluster heat map of each group of samples

2.3 OPLS-DA分析

為了了解花櫚木不同組織之間揮發(fā)性代謝物的差異情況,對(duì)根、枝、葉分別進(jìn)行差異分析,采用正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)模型進(jìn)行差異檢驗(yàn)。OPLS-DA分析是一種具有監(jiān)督模式識(shí)別的多元統(tǒng)計(jì)分析方法,能夠有效的剔除與研究無(wú)關(guān)的影響從而篩選差異代謝物。評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)參數(shù)有R2X、R2Y和Q2,其中R2X和R2Y分別表示所建模型對(duì)X和Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力,這3個(gè)指標(biāo)越接近于1時(shí)表示模型越穩(wěn)定可靠,Q2>0.5認(rèn)為是有效的模型,Q2>0.9為出色的模型。利用OPLS-DA對(duì)根、枝、葉組進(jìn)行成對(duì)的分析繪制得分圖(見(jiàn)圖3),OPLS-DA得分圖表明,不同的比較組中都發(fā)生明顯的分離。

圖3 OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plot注:A:根vs枝;B:根vs葉;C:枝vs葉Note:A:JPSG vs JPSJ;B:JPSG vs JPSY;C:JPSJ vs JPSY

2.4 差異代謝物篩選

2.4.1 差異代謝物分析

在根和枝的對(duì)比中,一共有340個(gè)差異代謝物,其中133個(gè)代謝物上調(diào)表達(dá),207個(gè)代謝物下調(diào)表達(dá);在根和葉的對(duì)比中,一共有330個(gè)差異代謝物,其中129個(gè)代謝物上調(diào),201個(gè)代謝物下調(diào);在枝和葉的對(duì)比中,一共有100個(gè)差異代謝物,其中72個(gè)代謝物上調(diào),28個(gè)代謝物下調(diào)(見(jiàn)表1)。根與枝、根與葉的差異代謝物以下調(diào)模式占主導(dǎo),萜類(lèi)、酯、雜環(huán)化合物、烴類(lèi)、酮、醇是差異代謝物的主要成分;萜類(lèi)、酯、雜環(huán)化合物是下調(diào)差異代謝物的主要組分,烴類(lèi)和醇中差異代謝物在根中顯著向上積累。枝與葉的差異代謝物以上調(diào)模式占主導(dǎo),萜類(lèi)是主要的上調(diào)組分。

2.4.2 顯著差異代謝物分析

再結(jié)合P-value值,進(jìn)一步篩選出不同部位間的顯著差異代謝物,認(rèn)為P-value<0.05的代謝物差異顯著。如圖4所示,根與枝對(duì)比顯著差異代謝物有294個(gè)(上調(diào)94個(gè)、下調(diào)200個(gè)),根與葉對(duì)比顯著差異代謝物有265個(gè)(上調(diào)70個(gè)、下調(diào)195個(gè)),枝與葉對(duì)比顯著差異代謝物有50個(gè)(上調(diào)35個(gè)、下調(diào)15個(gè))。差異倍數(shù)前20差異代謝產(chǎn)物(見(jiàn)表2和圖5)。其中根與枝中差異排在前20的代謝物均為下調(diào)代謝物(茅蒼術(shù)醇、二苯甲酮、蓽澄茄油烯醇、4-羥基-苯丙酸、τ-蘭油醇等),其中萜類(lèi)最多(12個(gè));根與葉中篩選出上調(diào)僅1個(gè)萜類(lèi)(大馬士酮),下調(diào)的化合物中和根與枝組相同的有16個(gè);葉與枝差異排在前20的代謝物中上調(diào)11個(gè)(大馬士酮、苯氧乙酸、2-羥基-1-苯基-1-丁酮、3-苯丙醇等),其中萜類(lèi)3個(gè)、酸2個(gè)、酮2個(gè)等,下調(diào)9個(gè)(2-乙?；量┩?、醋酸環(huán)己酯、2-丙基-呋喃等)。

表2 差異倍數(shù)前20的代謝物Table 2 The metabolites of the top 20 fold change

圖4 差異代謝物火山圖Fig.4 Volcanic map of differential metabolites注:A:根vs枝;B:根vs葉;C:枝vs葉。Note:A:JPSG vs JPSJ;B:JPSG vs JPSY;C:JPSJ vs JPSY

圖5 差異倍數(shù)前20的代謝物條形圖Fig.5 Bar chart of metabolites in the top 20 fold change注:A:根vs枝;B:根vs葉;C:枝vs葉。圖中左側(cè)編號(hào)對(duì)應(yīng)的化合物見(jiàn)表2。Note:A:JPSG vs JPSJ;B:JPSG vs JPSY;C:JPSJ vs JPSY.The numbers on the left correspond to the compounds in Table 2.

2.4.3 特有差異代謝物分析

韋恩圖顯示(見(jiàn)圖6),根vs枝中特有差異代謝物為22個(gè),根vs葉中特有差異代謝物為18個(gè),枝vs葉中特有差異代謝物為9個(gè)。根vs枝中特有差異代謝物主要是萜類(lèi)、烴類(lèi)和酯,根vs葉中特有差異代謝物主要為萜類(lèi),特有差異代謝物能作為區(qū)分不同部位揮發(fā)物的標(biāo)志性代謝物(見(jiàn)表3)。

表3 不同部位之間特有差異代謝物Table 3 Unique differential metabolites between different sites

圖6 特有差異代謝產(chǎn)物韋恩圖Fig.6 Venn diagram of unique differential metabolites

2.5 差異代謝物代謝通路分析

將不同比較組中所有的差異代謝物匹配KEGG的數(shù)據(jù)庫(kù)從而獲得代謝物參與的通路信息。對(duì)注釋完的結(jié)果進(jìn)行富集分析,獲得差異代謝物富集較多的通路,如圖7所示。差異代謝物主要注釋和富集在倍半萜和三萜生物合成、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、苯丙素的生物合成、檸檬烯和蒎烯的降解、泛醌等萜類(lèi)化合物的生物合成、單萜類(lèi)生物合成等途徑。其中,倍半萜和三萜生物合成通路為顯著富集的通路(P-value<0.05),有9個(gè)差異代謝物注解,包括反式-β-金合歡烯、α-法呢烯、Β-瑟林烯、β-紅沒(méi)藥烯、δ-杜松烯、大根香葉烯B、(E)-1-甲基-4-(6-甲基庚-5-烯-2-亞烷基)環(huán)己-1-烯、(Z)-1-甲基-4-(6-甲基庚-5-烯-2-亞烷基)環(huán)己-1-烯、法尼醛(見(jiàn)表4),其中,反式-β-金合歡烯、α-法呢烯、Β-瑟林烯在枝和葉中上調(diào)表達(dá),幾個(gè)重要的揮發(fā)性代謝物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖8。

表4 富集于倍半萜和三萜生物合成通路的差異代謝物Table 4 Differential metabolites enriched in sesquiterpene and triterpene biosynthetic pathways

圖8 幾個(gè)重要的揮發(fā)性代謝物結(jié)構(gòu)式Fig.8 Several important structural formulas for volatile metabolites 注:A:茅蒼術(shù)醇;B:大馬士酮;C:(+)-檸檬烯;D:β-紫羅蘭酮;E:α-松油醇;F:α-蒎烯;G:α-法呢烯;H:δ-杜松烯;I:大根香葉烯B;J:(E)-1-甲基-4-(6-甲基庚-5-烯-2-亞烷基)環(huán)己-1-烯;K:法尼醛。Note:A:Hinesol;B:(E)-1-(2,6,6-Trimethyl-1,3-cyclohexadien-1-yl)-2-Buten-1-one;C:D-Limonene;D:β-Ionone;E:L-α-Terpineol;F:α-Pinene;G:α-Farnesene;H:δ-Cadinene;I:Germacrene B;J:(E)-1-Methyl-4-(6-methylhept-5-en-2-ylidene)cyclohex-1-ene;K:3,7,11-Trimethyl-2,6,10-dodecatrienal.

3 結(jié)論

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)釋放揮發(fā)性成分,能凈化大氣、降低空氣中的細(xì)菌含量,進(jìn)入人體后能有效清除肺部有害物質(zhì),消除疲勞、改善睡眠、提高人體免疫力,并輔助治療癌癥和高血壓等一些慢性疾病[14]。植物不同部位均可釋放揮發(fā)性成分,對(duì)不同部位揮發(fā)性代謝物的研究,有助于植株不同部位的開(kāi)發(fā)利用。

本研究對(duì)花櫚木根、枝、葉三個(gè)部位的揮發(fā)性代謝物進(jìn)行代謝組學(xué)分析,共鑒定到589個(gè)揮發(fā)性代謝物,分為萜類(lèi)、酯、雜環(huán)化合物、烴類(lèi)等16類(lèi)化合物。從PCA的結(jié)果可以看出,不同部位之間存在差異;聚類(lèi)結(jié)果顯示,大多數(shù)代謝物在枝和葉中的含量相對(duì)較高。

根與枝、根與葉的差異代謝物為萜類(lèi)、酯、雜環(huán)化合物、烴類(lèi)和醇,其中萜類(lèi)、酯、雜環(huán)化合物、以下調(diào)模式為主,在根中豐度顯著下調(diào);烴類(lèi)和醇差異代謝物上調(diào)的占優(yōu),此2類(lèi)物質(zhì)在根中顯著向上積累。枝與葉的差異代謝物以上調(diào)模式占主導(dǎo),萜類(lèi)是主要的上調(diào)組分。

萜類(lèi)化合物是自然界中廣泛分布的、植物重要的揮發(fā)性化合物,具有抗腫瘤、抗菌消炎、鎮(zhèn)定安神功效,被廣泛應(yīng)用于香精香料、日化產(chǎn)品等諸多領(lǐng)域[15]。本研究在花櫚木中鑒定出162個(gè)萜類(lèi)代謝物。大多數(shù)萜類(lèi)化合物在根中累積量降低,在枝和葉中富集,在葉中含量較高,檸檬烯、β-紫羅蘭酮、α-蒎烯、α-松油醇、大馬士酮、雪松烯醇等萜類(lèi)成分累積量增加。這些化合物中多個(gè)被證實(shí)具有重要藥理活性和功效作用,如檸檬烯是單帖類(lèi)化合物重要代表成分之一,廣泛存在于檸檬、香橙、陳皮等植物中,具有很強(qiáng)的廣譜抑菌效果,對(duì)食源性致病菌、植物病原真菌等抑制效果好[16];β-紫羅蘭酮是一種重要的香料,也是合成視黃酸、視黃醇、β-胡蘿卜素和維生素A等的前體化合物,其對(duì)乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等有較強(qiáng)的抑制作用[17];α-蒎烯和α-松油醇是松節(jié)油的主要成分,是合成多種重要有機(jī)化合物的中間體,具有抑菌、消炎、抗癌等多種活性[18,19]。

根據(jù)差異代謝物代謝通路分析,差異代謝物在倍半萜和三萜生物合成通路中顯著富集。反式-β-金合歡烯、α-法呢烯、Β-瑟林烯、β-紅沒(méi)藥烯等9個(gè)差異代謝物參與該合成通路。倍半萜和三萜生物合成通路是萜類(lèi)合成的重要途徑之一,不同部位萜類(lèi)化合物含量差異與萜類(lèi)化合物有關(guān)基因的調(diào)控及相應(yīng)酶的催化密切相關(guān),相關(guān)調(diào)控基因需進(jìn)一步深入研究。

綜上,花櫚木枝和葉是揮發(fā)性代謝物富集較多的部位,具有多種重要活性的萜類(lèi)成分上調(diào)表達(dá),枝和葉是花櫚木的重要開(kāi)發(fā)利用部位,基于揮發(fā)性代謝物,可開(kāi)發(fā)成香粉、線(xiàn)香、精油等系列非木質(zhì)產(chǎn)品;此外,在森林康養(yǎng)領(lǐng)域,花櫚木可作為增益健康的樹(shù)種種植,在森林浴場(chǎng)、康養(yǎng)步道、戶(hù)外休閑場(chǎng)所等環(huán)境,發(fā)揮花櫚木揮發(fā)性代謝物的康養(yǎng)功效。