食管癌微轉(zhuǎn)移檢測技術(shù)及其臨床應(yīng)用研究進展

曾 薇 綜述 李惠武 審校

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1肺內(nèi)科一病區(qū), 2腫瘤研究所; 3新疆醫(yī)科大學(xué)科研中心, 烏魯木齊 830011)

食管癌位于世界常見惡性腫瘤的第8位，其治療模式的選擇基于美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)制定的食管癌TNM分期系統(tǒng)[1-3]。雖然目前以手術(shù)為主的化放療輔助綜合治療使食管癌患者的預(yù)后有了明顯的改善，但總體患者的1年生存率僅為75%左右[4]，術(shù)后5年生存率僅為20%～30%[5]，仍有許多患者死于腫瘤的局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移[6-7]。 目前研究證實，食管癌患者的不良預(yù)后與腫瘤微轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-9]。所謂腫瘤微轉(zhuǎn)移(micrometastasis)是指非血液系統(tǒng)惡性腫瘤在發(fā)展過程中，播散并存在于血液循環(huán)、淋巴道、骨髓及各組織器官中的腫瘤細胞，但尚未形成轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，且無任何臨床表現(xiàn)，常規(guī)病理學(xué)、影像學(xué)等方法難以發(fā)現(xiàn)和檢測到的一種微量轉(zhuǎn)移特征[10]。

近年來，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已開發(fā)出各種應(yīng)用于腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測的先進技術(shù)，并正在不斷完善，逐步走向臨床。本文就食管癌微轉(zhuǎn)移檢測的常用技術(shù)、標(biāo)記物及微轉(zhuǎn)移檢測的臨床意義進行分析和整理綜述如下。

1 食管癌微轉(zhuǎn)移檢測的常用技術(shù)

1.1蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE) 使用HE染色法檢測腫瘤微轉(zhuǎn)移，主要是通過觀察細胞的形態(tài)學(xué)改變來辨別腫瘤細胞。HE染色可顯示正常和病變組織的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)，便于長期保存、閱讀。但是，由于顯微鏡檢查的主觀性強，受到病理學(xué)醫(yī)師技術(shù)水平的影響大，且因多核細胞的存在以及隱匿性微轉(zhuǎn)移灶直徑較小使得細胞學(xué)檢查難度增大。Nagatani 等[11]分別采用HE染色、IHC法檢測CK表達，RT-PCR檢測SCC mRNA表達，來判斷22例食管癌的33枚氣管旁淋巴結(jié)中腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HE染色法檢測食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性率為50%，IHC法檢測陽性率為33.3%，RT-PCR技術(shù)為83.3 %；其中有1枚淋巴結(jié)使用HE染色法檢測呈陽性，但IHC法及RT-PCR技術(shù)檢測均呈陰性，提示在診斷淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移時，使用IHC法/RT-PCR技術(shù)結(jié)合HE染色進行分析，可降低檢測的假陰性率[11]。

1.2免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemicaltechniques,IHC) 目前，細胞角蛋白家族(cytokeratins, CKs)已成為最廣泛應(yīng)用于免疫組織化學(xué)檢測技術(shù)的上皮性標(biāo)記物[12]。免疫組織化學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于冰凍或石蠟包埋淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移的檢測，與HE染色相比，具有更好的敏感性。但是，不同實驗中心在免疫組化技術(shù)上的差別可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異。為改變這一現(xiàn)況，許多國際組織提出標(biāo)準(zhǔn)化免疫組化實驗技術(shù)，以利于更多前瞻性研究結(jié)果的評價[12]。Bagheri 等[13]采用IHC法對43例食管癌肋骨骨髓中CK的表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn),有13例患者骨髓中CK表達呈陽性(30.2%)，提示存在骨髓微轉(zhuǎn)移；進一步分析顯示，患者骨髓微轉(zhuǎn)移與腫瘤組織學(xué)分級和腫瘤縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Koenig等[14]采用IHC法檢測73例食管癌HE染色陰性淋巴結(jié)中AE1/AE3的表達，結(jié)果顯示,有25例患者淋巴結(jié)中AE1/AE3表達呈陽性(34.25%)，提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；進一步分析顯示，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陰性患者的5年生存率優(yōu)于微轉(zhuǎn)移陽性患者，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(76% vs 30%，P=0.021)。提示食管癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與患者的不良預(yù)后相關(guān)。

1.3RT-PCR技術(shù)(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction) RT-PCR技術(shù)通過檢測組織中特定mRNA標(biāo)記物來證實腫瘤細胞的存在，其中一些RNA標(biāo)記物如CK18、CK19、CK20、MUC1和CEA，已經(jīng)被作為評估上皮來源惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移的特異性分子標(biāo)記物[15]。RT-PCR技術(shù)檢測微轉(zhuǎn)移的敏感性可達10-6～10-7，較IHC技術(shù)和HE染色法高。但是，針對某些腫瘤標(biāo)記物呈低水平表達或在轉(zhuǎn)錄過程中表達下調(diào)的問題，許多研究機構(gòu)提出通過多中心實驗來界定檢測標(biāo)記物的陽性參考值，并積極開展多種標(biāo)記物聯(lián)合檢測的RT-PCR技術(shù)[15]。Altomare等[16]采用RT-PCR技術(shù)對68例pN0期、62例pN1期食管腺癌淋巴結(jié)中CK19、CK20、CEA和TACSTD1的表達進行檢測，并以53例食管良性病變的淋巴結(jié)作對照。結(jié)果顯示，68例pN0期食管腺癌中有30例患者淋巴結(jié)中至少有1種標(biāo)記物表達呈陽性(44%)，提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；62例pN1期食管腺癌中有40例患者淋巴結(jié)中至少有1種標(biāo)記物表達呈陽性(65%)，提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；術(shù)后隨訪2 a發(fā)現(xiàn)，pN0期食管腺癌淋巴結(jié)中存在3～4種標(biāo)記物陽性表達者的總生存期和無病生存期顯著差于標(biāo)記物均呈陰性表達者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Sun等[17]采用RT-PCR技術(shù)檢測82例pN0期食管癌淋巴結(jié)中MUC1 mRNA的表達。結(jié)果顯示，23例患者淋巴結(jié)中MUC1 mRNA呈陽性表達(28.1%)，提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；多因素分析顯示，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移、原發(fā)腫瘤大小是影響pN0期食管癌患者術(shù)后淋巴結(jié)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的獨立因素。

1.4其他檢測方法Western-blot是從蛋白質(zhì)水平來檢測食管癌的微轉(zhuǎn)移，還結(jié)合了腫瘤細胞特異性抗原抗體染色反應(yīng)，因此其檢測腫瘤蛋白質(zhì)的特異性和敏感性均很高；腫瘤細胞培養(yǎng)可將患者可疑微轉(zhuǎn)移的組織或體液進行克隆培養(yǎng)，使其增殖后再進行腫瘤細胞的檢測；生物芯片技術(shù)(biochip或bioarray)是根據(jù)生物分子間特異相互作用的原理，將生化分析過程集成于芯片表面，從而實現(xiàn)對DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)以及其他生物成分的高通量快速檢測。生物芯片技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟、平行化、自動化等特點，將成為一項現(xiàn)代化微轉(zhuǎn)移診斷的新技術(shù)[18]；蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)可從蛋白質(zhì)即生物功能執(zhí)行者入手，動態(tài)、整體、定量地研究腫瘤轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的變化，從細胞或組織蛋白質(zhì)整體水平來探討腫瘤的微轉(zhuǎn)移[19]。

2 食管癌微轉(zhuǎn)移檢測的常用標(biāo)記物

自1869年，Ashworth首先報道了1例腫瘤患者外周血中存在癌細胞以來，腫瘤微轉(zhuǎn)移的概念在實踐中逐步得到認識并成為近年來腫瘤轉(zhuǎn)移研究的熱點。目前常用于食管癌微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記有以下幾類。

2.1粘蛋白基因粘蛋白基因(MUC1)位于人染色體lq21-24區(qū)域，含有7個外顯子，其包括6個成員(mucin 1、2、3、4、5a、5b)，編碼上皮組織細胞膜上粘蛋白的核心蛋白。MUC1基因廣泛分布于正常食管黏膜，以及食管鱗癌、食管腺癌和Barrett食管黏膜中。正常情況下，覆蓋在食管黏膜表面的粘蛋白是保護黏膜層避免胃酸、胃蛋白酶等有害物質(zhì)侵蝕的第一道屏障，其表達水平會隨胃酸、胃蛋白酶刺激作用而升高[20]。但是，MCU1基因的過表達則與食管腺癌發(fā)生、食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[21]。Li等[22]采用RT-PCR技術(shù)對93例pN0期食管癌淋巴結(jié)中MUC1 mRNA的表達進行檢測。結(jié)果顯示，有32例患者淋巴結(jié)中MUC1 mRNA的表達呈陽性(34.41%)，提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；淋巴結(jié)中MUC1 mRNA陰性表達者的無病生存期、5年生存率顯著優(yōu)于陽性表達者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，多因素分析顯示，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的獨立因素。

2.2細胞角蛋白家族細胞角蛋白家族(cytokeratins, CKs)主要存在于上皮細胞胞漿中，是構(gòu)成細胞骨架的一類中間絲狀物。根據(jù)CKs相對分子質(zhì)量和等電點的不同，現(xiàn)在已知CKs由20個成員組成，即CK1～CK20。雖然CKs已廣泛應(yīng)用于上皮來源惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測，但是一些上皮來源惡性腫瘤中也存在某些CKs的表達缺失，這就可能導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性，所以選取適當(dāng)種類的CKs抗體或聯(lián)合其它標(biāo)記物進行檢測尤為重要。由于上皮組織惡變后，其表達的細胞角蛋白與正常組織基本相同，所以檢測間質(zhì)組織如骨髓、外周血、淋巴結(jié)中細胞角蛋白的表達被廣泛應(yīng)用于上皮來源惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移的診斷[23]。Marjanovic等[24]采用IHC法檢測70例pN0期食管癌根治術(shù)后患者淋巴結(jié)中CK的表達。結(jié)果顯示，有16例患者的淋巴結(jié)中CK表達呈陽性(23%)，提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；淋巴結(jié)中CK呈陰性表達者的5年生存率顯著優(yōu)于陽性表達者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(54% vs 30%，P<0.02)；多因素分析顯示，淋巴結(jié)中CK的表達是影響患者預(yù)后的獨立因素。

2.3癌胚抗原癌胚抗原 (CEA)最早在1965年由Gold和Freedman首先從胎兒及結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)，其編碼基因位于19號染色體，編碼分子量為22 ku的糖蛋白。CEA屬于非器官特異性腫瘤相關(guān)抗原，正常情況下，CEA經(jīng)胃腸道代謝，而腫瘤狀態(tài)時的CEA則進入血液和淋巴循環(huán)，使得食管癌患者的血清CEA水平升高。Imamura等[25]采用RT-PCR技術(shù)對35例食管癌患者術(shù)后淋巴結(jié)中CEA mRNA的表達進行檢測。結(jié)果顯示，淋巴結(jié)中CEA mRNA的陽性表達率為55.5%，提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；進一步分析顯示，CEA mRNA的陽性表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)顯性轉(zhuǎn)移、血管受侵顯著相關(guān)，提示對于淋巴結(jié)中CEA mRNA呈陽性表達者除了需要在術(shù)中充分地清掃淋巴結(jié)外，還應(yīng)在術(shù)后給予全身性輔助治療。Tanaka等[26]采用RT-PCR技術(shù)對244例食管癌根治術(shù)后患者外周血中CEAmRNA、SCCmRNA的表達進行檢測，并定義外周血中只要檢測到1種腫瘤標(biāo)記物mRNA呈陽性表達即可診斷存在微轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，有41例患者外周血中至少檢測到1種腫瘤標(biāo)記物mRNA呈陽性表達(16.8%)，提示存在外周血微轉(zhuǎn)移；進一步分析顯示，患者外周血中微轉(zhuǎn)移與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管受侵顯著相關(guān)；多因素分析顯示，外周血微轉(zhuǎn)移是影響患者術(shù)后無病生存期的獨立因素。

3 食管癌微轉(zhuǎn)移檢測的臨床意義

目前研究證實，腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測可用于精確臨床分期、判斷患者預(yù)后及預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[7]。通過對微轉(zhuǎn)移分子生物學(xué)特性的探討，可以為腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)研究提供新的見解和理念，使研究者能夠更好地理解腫瘤轉(zhuǎn)移的復(fù)雜生物學(xué)過程，有利于發(fā)現(xiàn)抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的新靶點，指導(dǎo)患者的臨床治療。同時，在現(xiàn)階段臨床腫瘤學(xué)研究中，急需實時監(jiān)測每位患者抗腫瘤治療效果的生物標(biāo)記，而新興的腫瘤微轉(zhuǎn)移研究則有著巨大的潛力來填補這一空白[12]。

3.1精確臨床分期Jiao等[8]使用胸/腹腔鏡對106例食管癌患者的331枚淋巴結(jié)進行活檢，在常規(guī)病理學(xué)檢查陰性的280枚淋巴結(jié)中，使用IHC法檢測CK的表達。結(jié)果顯示，有11枚淋巴結(jié)(3.9%)中CK表達呈陽性，提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，并因此有3例患者(4.3%)的臨床分期由N0上調(diào)至N1。

3.2預(yù)后判斷微轉(zhuǎn)移對患者預(yù)后的影響仍在進一步研究中，但是一些小型、單中心的研究已給出了陽性結(jié)果[27]。 Prenzel等[28]采用IHC法對48例食管癌HE染色呈陰性淋巴結(jié)中AE1/AE3的表達進行檢測。結(jié)果顯示，有7例患者淋巴結(jié)中AE1/AE3表達呈陽性(14.6%)，提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；進一步分析顯示，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性患者的5年生存率顯著低于陰性表達者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(57% vs 82%，P=0.02)；多因素分析顯示，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是影響食管癌患者預(yù)后的獨立因素。

3.3復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測Takeuchi等[29]采用PCR技術(shù)對82例pN0期食管癌淋巴結(jié)中MUC1 mRNA的表達進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有23例患者的淋巴結(jié)中MUC1mRNA呈陽性表達(28.1%)，提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；多因素分析顯示，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是影響pN0期食管癌患者術(shù)后淋巴結(jié)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的獨立因素。

3.4指導(dǎo)臨床治療對于術(shù)后患者來說，監(jiān)測術(shù)后外周血中微轉(zhuǎn)移可為每位患者的隨訪提供個體化的臨床信息；對于輔助化療后的患者來說，監(jiān)測化療后外周血中微轉(zhuǎn)移可幫助患者識別腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險，并使部分患者從二線治療中獲益；對于術(shù)前患者來說，通過現(xiàn)有的手段提高淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移的檢出率，可以使人們對食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模式有更深刻的理解，使早期食管癌患者(pN0)進行個體化、有選擇性的前哨淋巴結(jié)清掃成為可能，以期最大限度地減少患者的手術(shù)創(chuàng)傷，利于患者的術(shù)后恢復(fù)[30]。

總之，在今后工作中，微轉(zhuǎn)移檢測可能成為改善腫瘤患者預(yù)后的一個有價值的工具，根據(jù)微轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征指導(dǎo)患者實施個體化的臨床治療將成為可能。但是微轉(zhuǎn)移檢測在應(yīng)用于臨床實踐工作之前，仍有一些關(guān)鍵性問題有待解決。一是需要進行多中心試驗規(guī)范微轉(zhuǎn)移的檢測技術(shù),界定微轉(zhuǎn)移檢測標(biāo)記物的參考值；二是微轉(zhuǎn)移檢測在判斷患者預(yù)后、預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險中的價值，需要大型、多中心的臨床試驗驗證；三是目前存在10%～50%的腫瘤顯性轉(zhuǎn)移患者外周血標(biāo)本中微轉(zhuǎn)移檢測呈陰性，分析具體原因可能為微轉(zhuǎn)移病灶未表達所使用的檢測標(biāo)記物，以及微轉(zhuǎn)移病灶中檢測標(biāo)記物的表達水平低于檢測水平。因此，改進微轉(zhuǎn)移的檢測平臺，如使用芯片技術(shù)，可能在后期研究中克服這些問題[15]。

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