糖基化處理對(duì)綠豆分離蛋白功能特性的影響

王 曉，江連洲，李 楊，王中江，梁 婧，陳 勇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

糖基化處理對(duì)綠豆分離蛋白功能特性的影響

王 曉，江連洲*，李 楊，王中江，梁 婧，陳 勇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

為探討糖基化處理對(duì)綠豆分離蛋白的功能特性影響，通過(guò)測(cè)定接枝度，紅外光譜分析，以及對(duì)溶解性，乳化性和乳化穩(wěn)定性，起泡性和起泡穩(wěn)定性進(jìn)行了探究。結(jié)果表明：相比于麥芽糖，采用葡萄糖與綠豆分離蛋白反應(yīng)所得產(chǎn)物的接枝度較高，更易于反應(yīng)；紅外光譜顯示有蛋白和糖的共價(jià)復(fù)合物生成，且α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量升高，其他兩種二級(jí)結(jié)構(gòu)組成降低；糖基化后的綠豆分離蛋白溶解度得到改善，且葡萄糖優(yōu)于麥芽糖；糖基化后綠豆分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均得到提高，且麥芽糖效果更好；糖基化后綠豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均得到提高，且葡萄糖效果更明顯。

糖基化，綠豆分離蛋白，接枝度，紅外光譜，功能特性

綠豆在我國(guó)資源較豐富，在大部分的地區(qū)都有生產(chǎn)，目前國(guó)內(nèi)的綠豆加工主要以淀粉利用為主，淀粉生產(chǎn)中產(chǎn)生的綠豆蛋白等副產(chǎn)物尚未得到充分利用，其中它的蛋白含量高達(dá)19.15%～33.11%，包含各種氨基酸種類(lèi)，特別是賴(lài)氨酸含量豐富，接近在雞蛋中的含量[1]。盡管綠豆蛋白具有一定的功能性質(zhì)，但其較低的溶解性限制了它在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用，而且其乳化性等性質(zhì)與某些動(dòng)物源蛋白質(zhì)相比有較大差距，因此需要對(duì)綠豆蛋白進(jìn)行改性，以期獲得優(yōu)良的功能特性。

國(guó)內(nèi)外有對(duì)綠豆蛋白的研究報(bào)道，Adsuale對(duì)綠豆分離蛋白營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)作了全面綜述[1]，曾志紅等對(duì)綠豆分離蛋白的功能性質(zhì)進(jìn)行初步研究[2]，但對(duì)改性綠豆分離蛋白營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與功能特性的研究仍非常欠缺。常用的改性方法包括物理改性[3]，化學(xué)改性和酶法改性[4]，其中糖基化修飾是一種較為理想的改性方法，具有自發(fā)進(jìn)行、無(wú)需添加化學(xué)試劑、加熱即可加速反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，可以有效提高蛋白質(zhì)的功能特性。Sun等將還原糖與乳清蛋白進(jìn)行糖基化反應(yīng)后，其功能性質(zhì)顯著提高[5]。Groubet等將多種還原糖與β-酪蛋白進(jìn)行反應(yīng)后，接枝產(chǎn)物的溶解性得到了一定改善[6]。蘇志光等將甘露聚糖與大豆分離蛋白糖基化生成糖蛋白，其溶解性顯著提高[7]。但由于經(jīng)糖基化處理后許多氨基酸失去了原有功能，是營(yíng)養(yǎng)流失的主要原因，并且其過(guò)程產(chǎn)生了雜環(huán)胺等有害中間產(chǎn)物，產(chǎn)生極大安全隱患，所以產(chǎn)物在應(yīng)用于食品加工前，應(yīng)對(duì)安全性和營(yíng)養(yǎng)性進(jìn)行進(jìn)一步研究。前人研究了糖基化改性對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的影響，但多數(shù)都是運(yùn)用干熱法制備多糖與蛋白復(fù)合物而進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定經(jīng)濕熱法在不同時(shí)間和溫度制得的葡萄糖和麥芽糖與綠豆分離蛋白糖基化產(chǎn)物的溶解性、乳化性等，分析糖基化溫度和時(shí)間對(duì)其功能性質(zhì)的影響，為采用糖基化處理提高其功能特性提供理論依據(jù)，并尋找出廣泛應(yīng)用于食品中的高性能食品添加劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠小豆 黑龍江北大荒集團(tuán)；Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司；SDS Sigma公司；TNBS 上海寶曼生物科技有限公司。

JZ7114型粉碎機(jī) 上海朝陽(yáng)微電機(jī)廠；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)SIM公司；Allegra64R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；TU-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；磁力攪拌器、高速乳化均質(zhì)機(jī) 廣州儀科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MAGNA-IR560傅立葉變換紅外光譜系統(tǒng) 美國(guó)尼高力公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠豆分離蛋白的提取 綠豆經(jīng)除雜后，采用堿溶酸沉法提取綠豆分離蛋白[8]，提取流程參見(jiàn)圖1。

圖1 綠豆分離蛋白的制備Fig.1 Preparation of mung bean protein isolates

1.2.2 糖基化蛋白的制備 將5g綠豆分離蛋白和10g葡萄糖（10g麥芽糖），混合均勻后，溶于400mL的蒸餾水中，攪拌，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8并定容至500mL，得到蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL的溶液。將溶液轉(zhuǎn)移到燒杯中，置于60℃（70℃）水浴中加熱，每隔1h取樣30mL，放于離心管中，用冷水快速冷卻后待測(cè)[9]。

1.2.3 接枝度的測(cè)定 取125μL的反應(yīng)液與2.0mL pH為8.2的磷酸緩沖液混合，并加入1.0mL 0.01%的TNBS，使其充分混合，避光條件下50℃水浴加熱30min，加入2.0mL的0.1mmol/L的亞硫酸鈉終止反應(yīng)，在室溫下放置15min，在相同操作條件下采用蒸餾水代替反應(yīng)液作為空白對(duì)照。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定在420nm的吸光值。根據(jù)L-亮氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定自由氨基含量[10]。

式中：C0：未反應(yīng)時(shí)自由氨基含量，Ct：反應(yīng)時(shí)間t時(shí)自由氨基含量。

1.2.4 傅里葉紅外光譜檢測(cè) 將凍干樣品置于干燥器內(nèi)充分干燥，稱(chēng)取樣品1mg，與100mg溴化鉀研磨混勻壓片測(cè)定FTIR。在數(shù)據(jù)采集期間，為了減少水蒸汽IR吸收的干擾，持續(xù)用干燥的N2淋洗測(cè)量室。在與樣品測(cè)定完全相同的條件下在室溫敞開(kāi)狀態(tài)收集空氣背景。測(cè)定在波數(shù)范圍為4000～400cm-1的吸收光譜，分辨率4cm-1，波數(shù)精度0.01cm-1，掃描次數(shù)64次，環(huán)境溫度25℃。

1.2.5 溶解度的測(cè)定 稱(chēng)取100mg蛋白樣品分散于10mL的去離子水中，磁力攪拌30min，在20℃下12000×g離心20min。上清液經(jīng)適度稀釋?zhuān)捎肔owry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)量濃度占總蛋白質(zhì)量濃度的百分比[11]。

1.2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 取10mL蛋白質(zhì)反應(yīng)液與2mL大豆油混合，放入離心管中，在機(jī)械乳化機(jī)中乳化2min，迅速將乳化液倒入25mL的燒杯中。在距燒杯底部0.5cm處取樣，取50μL的乳化液，迅速與10mL 0.1%的SDS混合，在500nm處測(cè)定吸光度，空白對(duì)照用0.1%的SDS[12]。

式中，N：稀釋倍數(shù)；C：乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度（g/mL）；Φ：乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)（L/L）。

1.2.7 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定 稱(chēng)取1g樣品溶于100mL去離子水，置于500mL量筒中，均質(zhì)40s，連續(xù)3次共計(jì)2min，記錄均質(zhì)后液面高度為V0（mL），靜置30min后記錄為V30min（mL）[13]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)都是三次測(cè)定的平均值，利用一維方差分析的LSD比較樣品平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化反應(yīng)對(duì)接枝度的影響

為表征綠豆分離蛋白與還原糖的反應(yīng)程度，分別測(cè)定了綠豆分離蛋白與葡萄糖和麥芽糖反應(yīng)后接枝度的變化。隨著加熱時(shí)間的增加，不同溫度反應(yīng)體系的接枝度均顯著提高（p＜0.05），且葡萄糖與綠豆分離蛋白的接枝度高于麥芽糖。從圖2可以看出，在240min時(shí)，接枝程度最大，其相差也較大，可能是由于在相同質(zhì)量的情況下，單糖羰基含量更高，增加了羰基和氨基的結(jié)合率，有利于反應(yīng)的進(jìn)行，跟前人的研究發(fā)現(xiàn)一致，糖基化反應(yīng)中，糖基的分子質(zhì)量越大，反應(yīng)進(jìn)行的程度越低，而分子質(zhì)量越小，反應(yīng)量越大[14]。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)與糖的接枝反應(yīng)程度增加變緩，這可能因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的蛋白質(zhì)與糖的發(fā)生接枝反應(yīng)的同時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間出現(xiàn)不同程度的 熱 聚 集[15]，使 得 反 應(yīng) 體 系 中 的 不 溶 性 組 分 大 大 增加，抑制接枝反應(yīng)的進(jìn)行。

圖2 接枝度的變化Fig.2 Changes of the degree of grafting

2.2 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜是一種目前常用的分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，可靈敏地反映出肽鏈結(jié)構(gòu)的一些變化[16]。經(jīng)過(guò)4h的糖基化反應(yīng)，確定紅外光譜圖3，表明不同糖基化處理，呈現(xiàn)不同的糖基化程度。在3500～3200cm-1之間的寬峰是O-H和N-H的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明存在分子間和分子內(nèi)的氫鍵，3000～2800cm-1的峰是糖類(lèi)C-H伸縮振動(dòng)，表明此物質(zhì)為糖類(lèi)復(fù)合物[17]。

其次選取了紅外光譜的酰胺I帶來(lái)分析綠豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，采用Peakfit軟件對(duì)蛋白質(zhì)酰胺I帶進(jìn)行傅立葉變換去卷積，進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)峰擬合，得到 子 峰 數(shù) 目 在9 ～13之 間 ，其 殘 差（r2）大 于0.96，確 認(rèn)峰位歸屬，計(jì)算各子峰面積的相對(duì)百分含量，測(cè)定3次，取平均值。各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系的指認(rèn)為 ：1615～1640cm-1和1670～1690cm-1β-折 疊 ；1650 ～1660cm-1為α-螺旋；1640～1650cm-1為無(wú)規(guī)則卷曲；1660～1700cm-1為β-轉(zhuǎn)角[18-19]。如表1所示，通過(guò)紅外光譜酰胺I帶分析可知，經(jīng)糖基化處理后綠豆蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量有所升高，β-折疊結(jié)構(gòu)含量有所降低，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量小幅升高，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量小幅降低。推測(cè)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量升高主要是由多肽鏈上羰基（-CO）和氨基（NH-）之間的氫鍵被破壞，蛋白質(zhì)的聚集使β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少，β-轉(zhuǎn)角比例增加可能是加熱作用下α-螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部氫鍵作用被破壞，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)這種轉(zhuǎn)變表明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)重組，可能是亞基解離和聚合。

圖3 糖基化產(chǎn)物紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of glycosylation products

表1 糖基化綠豆分離蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶擬合結(jié)果Table 1 Fitting results of secondary structure of glycosylation protein by amide I band

2.3 糖基化反應(yīng)對(duì)溶解度的影響

不同反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性分別如圖4所示，隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，溶解度得到改善，不同溫度反應(yīng)體系的溶解度均顯著提高（p＜0.05），反應(yīng)2h后趨于平緩，且葡萄糖高于麥芽糖。這與Achouri等[20]的研究結(jié)果一致，表明大豆球蛋白（11S）與葡萄糖發(fā)生接枝反應(yīng)后，在一定時(shí)間內(nèi)其產(chǎn)物溶解性隨時(shí)間增加逐漸變大。可能原因是在反應(yīng)初期，由于綠豆蛋白分子引入了糖鏈，為其增加了親水性羥基，增加了蛋白質(zhì)分子的親水性，而且加熱處理有助于蛋白質(zhì)溶解度的提高，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，親水性羥基增加的效果不顯著，在反應(yīng)后期，溶解度增加平緩，可能是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，造成部分蛋白分子的熱聚集，使其溶解度增加變緩。葡萄糖糖基化產(chǎn)物的溶解性要高于麥芽糖糖基化產(chǎn)物。蛋白質(zhì)具有特定的空間結(jié)構(gòu)，接上糖鏈之后，空間結(jié)構(gòu)被破壞，使蛋白質(zhì)分子極性增強(qiáng)，其次多羥基的親水特性也可使得整個(gè)分子的溶解性明顯提高[21]。但由于糖鏈長(zhǎng)度不同，產(chǎn)生了不同的空間位阻效應(yīng)，糖鏈越長(zhǎng)，效應(yīng)越明顯，進(jìn)而阻止糖蛋白的空間展開(kāi)，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，致使溶解度降低，出現(xiàn)葡萄糖優(yōu)于麥芽糖的現(xiàn)象。

圖4 接枝產(chǎn)物溶解度的變化Fig.4 Changes on the solubility of the graft products

2.4 糖基化反應(yīng)對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

將綠豆分離蛋白分別與葡萄糖和麥芽糖在水浴條件下進(jìn)行反應(yīng)，不同反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別如圖5和圖6所示。隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，乳化活性和乳化穩(wěn)定性得到改善，均顯著提高（p＜0.05），且整體上麥芽糖要高于葡萄糖。劉燕等研究也表明糖基化后的大豆蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性有不同程度的提高[22]。對(duì)乳化活性而言，麥芽糖要強(qiáng)于葡萄糖，當(dāng)反應(yīng)到一定程度后，乳化活性達(dá)到最高，但出現(xiàn)糖基化產(chǎn)物乳化活性增加的幅度不斷減小，甚至出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。前人在研究大豆分離蛋白和半乳甘露聚糖的糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的乳化性時(shí)[23]，同樣出現(xiàn)隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，復(fù)合物的乳化活性將經(jīng)歷上升和下降兩個(gè)過(guò)程，開(kāi)始糖與蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，由于糖的親水性使產(chǎn)物的表面活性增加，從而乳化性得到提高，但當(dāng)反應(yīng)達(dá)到一定程度后，其交聯(lián)程度越來(lái)越高，使產(chǎn)物過(guò)于親水而失去界面活性，從而降低了產(chǎn)物的乳化性。對(duì)于乳化穩(wěn)定性而言，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，分子間空間位阻增大，更加有效地阻止了油滴的聚集和乳化狀態(tài)的破壞，從而提高了蛋白分子的乳化穩(wěn)定性，相同反應(yīng)時(shí)間下，麥芽糖與綠豆分離蛋白的糖基化產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性比葡萄糖好，說(shuō)明麥芽糖比葡萄糖更有利于改善綠豆分離蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性。

圖5 接枝產(chǎn)物乳化活性的變化Fig.5 Changes on the emulsifying activity of graft products

圖6 接枝產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性的變化Fig.6 Changes on the emulsion stability of graft products

2.5 糖基化反應(yīng)對(duì)起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)能作為起泡劑主要取決于蛋白質(zhì)的表面活性和成膜性，水溶性蛋白質(zhì)可被起泡吸附以降低表面張力，使蛋白質(zhì)逐漸凝固在氣液界面間形成有一定剛性和彈性的薄膜[24]。將綠豆分離蛋白分別與葡萄糖和麥芽糖在水浴條件下進(jìn)行反應(yīng)，不同反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)物的起泡性和起泡穩(wěn)定性分別如圖7和圖8所示。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，糖基化蛋白的起泡性和蛋白質(zhì)的起泡性和起泡穩(wěn)定性都得到了改善，均顯著提高（p＜0.05），起泡性呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，起泡穩(wěn)定性穩(wěn)步升高，且葡萄糖要高于麥芽糖。魯倩等研究也表明糖基化修飾可有效提高起泡性[25]。加熱時(shí)間延長(zhǎng)，起泡能力先升高再降低，這是可能因?yàn)楫?dāng)糖鏈接入到蛋白分子上，其親水基團(tuán)會(huì)增加蛋白的水溶性，增加起泡能力，隨后所發(fā)生的起泡力下降的可能原因是交聯(lián)后的蛋白質(zhì)分子量會(huì)明顯增大，蛋白質(zhì)分子的空間位阻以及糖鏈所引起的強(qiáng)烈電荷效應(yīng)導(dǎo)致接枝物的起泡力隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。起泡穩(wěn)定性的穩(wěn)定升高，可能由于分子引入了羥基，使得分子間的靜電作用增強(qiáng)，分子間的靜電吸引力增加了在空氣與水界面上蛋白質(zhì)膜的厚度和硬度，從而使的接枝物的泡沫穩(wěn)定性增強(qiáng)。相比較而言，葡萄糖效果要明顯，這可能由于分子量和粘度的不同決定了它們起泡性能間的差異。

圖7 接枝產(chǎn)物起泡性的變化Fig.7 Changes on the foaming capability of graft products

圖8 接枝產(chǎn)物泡沫穩(wěn)定性的變化Fig.8 Changes on the foam stability of graft products

3 結(jié)論

采用堿溶酸沉法提取綠豆分離蛋白，通過(guò)水浴加熱制得糖基化產(chǎn)物，并對(duì)其功能特性進(jìn)行了測(cè)定。經(jīng)測(cè)定四種糖基化產(chǎn)物的接枝度隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，葡萄糖的接枝程度大于麥芽糖，紅外光譜也驗(yàn)證了蛋白質(zhì)和糖共價(jià)結(jié)合成了聚糖分子，且二級(jí)結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生了變化，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量有所升高，β-折疊結(jié)構(gòu)含量有所降低，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量小幅升高，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量小幅降低，溶解度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，葡萄糖糖基化產(chǎn)物的溶解性要高于麥芽糖糖基化產(chǎn)物，乳化活性和乳化穩(wěn)定性逐漸得到提高，且麥芽糖改善效果較好，起泡性和起泡穩(wěn)定性都得到了改善，葡萄糖效果較明顯，為充分利用綠豆蛋白這一植物蛋白提供了基本的理論和方法。

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Effect of glycosylated processing on functional properties of mung bean protein isolate

WANG Xiao，JIANG Lian-zhou*，LI Yang，WANG Zhong-jiang，LIANG Jing，CHEN Yong
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In order to explore functional properties of mung bean protein isolate by glycosylated processing ，the degree of grafting，infrared spectroscopy，as well as solubility，emulsification and emulsion stability，foaming and foaming stability were investigated.The results demonstrated that compared to maltose ，the grafting degree of the resulting reaction product by using glucose was higher than the maltose，and it was easier to react.Infrared spectroscopy showed sugar and protein covalent complexes were generated.The content of α -helix and β-turn structure increased，while the other two structures decreased.The solubility of mung bean protein isolate after glycosylation was improved，and the result with glucose was better than that with maltose.The emulsifying activity and emulsion stability of mung bean protein isolate after glycosylation were improved，and the reaction with maltose had better results.The foaming and foam stability of mung bean protein isolate after glycosylation were improved，and the effect of glucose was more pronounced.

glycosylation；mungbeanproteinisolate；degreeofgrafting；infraredspectroscopy；functionalproperties

TS214.9

A

1002-0306（2014）20-0097-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.012

2014－04-08

王曉（1989-），男，碩士研究生，研究方向：食品工程。

* 通訊作者：江連洲（1960-），男，博士，教授，研究方向：糧食，油脂及植物蛋白工程。

國(guó)家自然科學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301501）。