熒光原位雜交技術(shù)在Y染色體微缺失患者中的應(yīng)用

杜生榮，康躍凡，徐兩蒲，黃海龍，鄭備紅，林典梁，孫 艷，陳文禎

熒光原位雜交技術(shù)在Y染色體微缺失患者中的應(yīng)用

杜生榮1，康躍凡1，徐兩蒲2，黃海龍2，鄭備紅1，林典梁1，孫 艷1，陳文禎1

目的探討熒光原位雜交技術(shù)在Y染色體微缺失患者中的應(yīng)用價(jià)值。方法輔助生育中借助顯微操作系統(tǒng)，在卵裂期6～8細(xì)胞中活檢1～2個細(xì)胞行熒光原位雜交，選擇核型為46，XX的胚胎移植。結(jié)果在活檢的11個胚胎中，染色體核型異常的2枚，46，XX的胚胎8枚，46，XY的胚胎1枚。移植核型46，XX的2枚胚胎獲單胎妊娠出生正常女嬰。結(jié)論對Y染色體微缺失的患者，通過胚胎植入前遺傳學(xué)診斷選擇女性胚胎移植，可有效阻斷遺傳性疾病傳遞給下一代。

Y染色體；胚胎移植；少精子癥；原位雜交，熒光；植入前診斷

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）技術(shù)是指通過體外受精獲得胚胎，在胚胎培養(yǎng)第3d（6～8細(xì)胞）活檢1～2個卵裂球或者囊胚期活檢5～10個滋養(yǎng)層細(xì)胞，或取卵子極體活檢，對其進(jìn)行遺傳分析（包括染色體分析和基因芯片分析）。PGD技術(shù)能診斷部分遺傳性疾病，防止有遺傳病的患兒出生。熒光原位雜交技術(shù)（flourescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）主要用于染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常（羅氏易位、平衡易位等）的診斷。男性不育癥患者中，Y染色體微缺失檢測示長臂無精子因子（azoospermia factor，AZF）與精子的發(fā)生密切相關(guān)，包括AZFa、AZFb、AZFc與AZFd區(qū)，AZF缺失患者可以導(dǎo)致無精子癥、弱精子癥或者重度少弱畸形精子癥影響生育。這類患者可以借助卵胞漿單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技術(shù)來實(shí)現(xiàn)妊娠，但是通過ICSI手段妊娠后，可能會把遺傳性狀傳遞給后代，給患者家庭帶來精神和經(jīng)濟(jì)的負(fù)擔(dān)。對這類Y染色體微缺失的患者可通過FISH技術(shù)選擇女性胚胎移植，以阻斷致病基因的遺傳，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生的目的，筆者單位于2012年使用PGD技術(shù)成功誕生一健康女嬰，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 患者女性，27歲，婚后3年未孕，月經(jīng)規(guī)則，基礎(chǔ)體溫雙相。宮腔正常，左側(cè)輸卵管通而不暢，右輸卵管通暢。夫多次精液常規(guī)檢查示：“重度少弱精子癥”（精子計(jì)數(shù)1～2／10HP），染色體核型46，XY，Y 染色體微缺失，AZFd（sy152），AZFc（sy254，sy255）缺失。

1.2 方法

1.2.1 輔助生育與體外受精 采用常規(guī)GnRH－a長方案控制超排卵，監(jiān)測卵泡發(fā)育成熟，肌肉注射HCG，36h取卵；收集好的卵母細(xì)胞去顆粒細(xì)胞、顯微注射單精子入卵胞漿內(nèi)，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.06的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 胚胎活檢 胚胎培養(yǎng)第3d選擇6～8個細(xì)胞評分2級以上的卵裂期胚胎，用持卵針固定胚胎，激光在胚胎的透明帶上打一個“V”形的口，活檢針通過“V”形口吸取出1～2個卵裂球。

1.2.3 卵裂球固定 用金剛筆在干凈的玻片背面作標(biāo)記，將活檢的單個卵裂球轉(zhuǎn)移到0.1mol／L HCl／0.2%Tween-20低滲破膜2～3min，然后滴加甲醇／冰乙酸（3∶1）5min，干燥后雜交。

1.2.4 熒光原位雜交 70%的甲酰胺變性液73℃預(yù)溫，將載有樣品的玻片在變性液中變性5min，變性后將玻片放在70%、85%的冰乙醇中各1min，再轉(zhuǎn)到100%的冰乙醇中放置3min，將配制好的探針（Vysis探針，上?；蚬荆┰谧冃砸褐凶冃?min，最后將探針加到放有卵裂球的區(qū)域，加蓋玻片，用膠將玻片的四周封片。雜交后將玻片放在濕盒中37℃過夜。將2×SSC，0.1%NP40在37℃預(yù)溫，將蓋玻片揭開，在此液中洗30s，再轉(zhuǎn)移到1×SSC，0.3%NP 40中洗2min，待玻片干后，加10μL的DAPI染色10min后，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

本實(shí)驗(yàn)總共活檢11個胚胎，11個卵裂球，活檢的每個卵裂球均編序號，1號胚胎，11號胚胎染色體異常（圖1A）；6號胚胎染色體核型為46，XY（圖1B），3，4，7號胚胎活檢后未形成囊胚淘汰（表1）；2，5，8，9，10染色體為女性胚胎（圖1C，D），新鮮周期移植2，8號胚胎未孕；1月后，解凍9，10號胚胎移植，移植后第14d測定血絨毛膜促性腺激素升高，妊娠7周B超檢查提示為單胎，可見胚芽與原始胎心搏動，妊娠20周羊膜腔穿刺，胎兒羊水細(xì)胞G顯帶染色，染色體核型46，XX，患者繼續(xù)妊娠至足月，于2013年6月2日順利分娩一健康女嬰。

表1 第3d新鮮胚胎活檢Tab 1 The fresh embryo biopsied on the third day

圖1 FISH熒光圖片F(xiàn)ig 1 The images of FISH fluorescence

3 討 論

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，育齡夫婦中不孕不育癥約10%～15%，男性因素導(dǎo)致不育占50%，其中由于遺傳因素導(dǎo)致不育的占30%，而Y染色體微缺失是引起男性不育的主要遺傳因素。目前已知AZF的微缺失主要分布在Y染色體長臂AZFa、AZFb、AZFc與AZFd非重疊區(qū)域。研究證明：AZFa缺失導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征，最終影響精子的發(fā)育；AZFb缺失的患者表現(xiàn)為精子成熟障礙，發(fā)育停滯在精母細(xì)胞階段；AZFc缺失主要表現(xiàn)為少精子癥；AZFb和AZFc同時(shí)缺失會導(dǎo)致無精子癥，即使通過經(jīng)皮穿刺附睪取精或者睪丸取精，都難以獲得精子，患者只能通過供精人工受精（AID）完成生育；AZFc、AZFd缺失主要表現(xiàn)為重度少弱畸精子癥，此類患者可行卵胞漿單精子注射，獲得Y染色體AZFc微缺失基因垂直遺傳的男性嬰兒，后代可具有相同的遺傳類型或者可能最終導(dǎo)致無精子癥，喪失生育力［1－3］。日本學(xué)者對Y染色體微缺失患者經(jīng)ICSI生育的一個家族進(jìn)行隨訪，3個兒子中，2個兒子有著與其父同樣遺傳缺失，而另一個兒子遺傳缺失的范圍更廣，說明Y染色體的微缺失通過輔助生殖手段遺傳缺失的片段可能會變長［4－5］。為了避免這樣遺傳背景的延續(xù)，需要新的輔助手段，即胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)，對Y染色體為微缺失的患者，通過PGD選擇女性胚胎移植，獲得正常女嬰，可以解除不育夫婦的精神負(fù)擔(dān)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，最終達(dá)到優(yōu)生的目的。

本例為福建省第一例PGD試管嬰兒成功病例，在成功之前，曾預(yù)實(shí)驗(yàn)了15個廢棄胚胎，從預(yù)實(shí)驗(yàn)中筆者總結(jié)了些經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)：

3.1 卵裂球的固定 首先，活檢胚胎前玻片須用無水乙醇擦洗，否則卵裂球很容易脫落，微小的疏忽也會導(dǎo)致全局的失敗。其次，細(xì)胞固定不必常規(guī)經(jīng)1%乙酸鈉低滲處理，改為直接在磷酸緩沖液漂洗后，移至載玻片標(biāo)定區(qū)域內(nèi)的1～2μL 0.01%Tween-20／0.01mol／L HCl中［6］，待液體（盡量少）自然干燥，及時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞從膨脹，破裂到核游離，待細(xì)胞完全干燥后，再加入甲醇／冰醋酸除去殘留細(xì)胞質(zhì)。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中，7枚胚胎活檢后出現(xiàn)細(xì)胞核丟失，原因玻片沒有經(jīng)過處理或者單細(xì)胞移到Tween-20／HCl后沒有及時(shí)在倒置顯微鏡鏡觀察，改良實(shí)驗(yàn)方法后8枚胚胎固定后均可見裸露的細(xì)胞核）。

3.2 準(zhǔn)確尋找細(xì)胞核的位置 玻片中常出現(xiàn)自發(fā)熒光的物質(zhì)，容易誤判為細(xì)胞核。應(yīng)先用低倍鏡找到鉆石筆畫的小圈，再用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋微調(diào)，找到細(xì)胞核的位置，轉(zhuǎn)換油鏡時(shí)，注意鏡頭不要觸碰蓋玻片，根據(jù)不同顏色的激發(fā)光觀察染色體。

除以上報(bào)道的已經(jīng)出生的PGD試管嬰兒外，筆者所在診斷中心總共對7例患者因染色體問題進(jìn)行PGD，其中4例Y染色體微缺失，2例嵌合體，1例為平衡易位，羊水細(xì)胞均證實(shí)FISH結(jié)果準(zhǔn)確，妊娠率為57.14%（4／7）。說明已完全掌握PGD技術(shù)，從胚胎活檢，固定，F(xiàn)SIH檢測，方法可靠，結(jié)果準(zhǔn)確。

總之，F(xiàn)ISH技術(shù)可以診斷男性Y染色體微缺失的疾病，也可診斷染色體疾?。ò〝?shù)目和結(jié)構(gòu)的畸變），選擇正常的胚胎移植，可以降低染色體易位導(dǎo)致的反復(fù)自然流產(chǎn)率。通過FISH技術(shù)結(jié)合輔助生殖技術(shù)可以把產(chǎn)前診斷提早到孕前，避免遺傳患兒的妊娠、流產(chǎn)與出生，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育目的，值得臨床推廣應(yīng)用。

［1］Krausz C，Quintana-Murci L，McElreavey K.Prognostic value of Y deletion analysis：What is the clinical prognostic value of Y chromosome microdeletion analysi［J］.HumReprod，2000，15（7）：1431-1434.

［2］高小燕，楊國鋒，孫 燕，等.AZF微缺失與男性不育［J］.生殖與避孕，2006，26（5）：302-306.

［3］劉曉紅，閆麗盈，喬 杰，等.Y染色體微缺失與輔助生殖技術(shù)關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.生殖與避孕，2013，1（33）42-47.

［4］朱曉斌，李 錚，郭安亮，等.Y染色體微缺失父子間垂直遺傳分析［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2007，24（2）：203-205.

［5］Komori S，Kato H，Kobayashi S，etal.Transmission of Y chromosomal microdeletions from father to son through intracytoplasmic sperm injection［J］.JHumGenet，2002，47（9）：465-468.

［6］黃國寧，孫海翔，李 剛，等.體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：353-357.

（編輯：常志衛(wèi)）

Application of Fluorescence in Stiu Hybridization Technique for Patients of Y-chromosome Microdeletion

DU Shengrong1，KANG Yuefan1，XU Liangpu2，HUANG Hailong2，ZHENG Beihong1，LIN Dianliang1，SUN Yan1，CHEN Wenzhen1
1.The Reproduction Medical Center of the Hospital for Women and Children of Fujian Province，F(xiàn)uzhou 350001，China；
2.The Prenatal Diagnosis Center of the Hospital for Women and Children of Fujian Province，F(xiàn)uzhou 350001，China

ObjectiveEstablishing aplatform to evaluate the value of fluorescence in stiu hybridization for detecting Y-chromosome microdeletion.MethodsOne or two biopsies from six to eight cells at the cleavage stage were used to perform the fluorescence in stiu hybridization. The embryo whose karyotype was 46，XX was transferred.. ResultsEleven embryos biopsies were observed，among which 8 were 46，XX，2were abnormal and only one was 46，XY. After two embryos of karyotype 46，XX were transferred，one healthy baby girl was born.Conclusions Fluorescence in stiu hybridization is effective in preventing the next generation from inheriting genetic defects and has crucial role in preimplantation genetic diagnosis.

mosome；embryo transfer；oligospermia；in situ hybridization，fluorescence；preimplantation diagnosis

R329.24；R392-33；R698.202

A

1672-4194（2014）01-0047-03

2013-12-07

福建省計(jì)劃生育重點(diǎn)?？祈?xiàng)目（閩財(cái)指20121589）；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2013-ZQN-ZD-6）

福建省婦幼保健院，福州 350001 1.生殖研究室；2.產(chǎn)前診斷中心

杜生榮（1982－），男，檢驗(yàn)師，發(fā)育生物學(xué)碩士

康躍凡.Email：fjkyf＠163.com