CPP-ACP及氟促進(jìn)脫礦牙骨質(zhì)再礦化的體外實(shí)驗(yàn)

馬忠雄，盧友光，盧國(guó)英

CPP-ACP及氟促進(jìn)脫礦牙骨質(zhì)再礦化的體外實(shí)驗(yàn)

馬忠雄，盧友光，盧國(guó)英

目的比較普通含氟牙膏、酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合體（CPP-ACP）及含氟CPP-ACP（CPP-ACPF）促進(jìn)脫礦牙骨質(zhì)再礦化的效果。方法制備健康牙骨質(zhì)塊，開(kāi)窗后脫礦液脫礦96h，分為空白對(duì)照組、普通含氟牙膏組、CPP-ACP組和CPP-ACPF組，每組10個(gè)樣本，將實(shí)驗(yàn)藥品按要求在牙骨質(zhì)表面反復(fù)涂擦3min，流水沖洗5min，每天1次。28d后掃描電鏡觀察各組牙骨質(zhì)表面形貌，通過(guò)能譜分析測(cè)定牙骨質(zhì)表面的微區(qū)成分（Ca、P含量及Ca／P），采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組間Ca、P、Ca／P進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果掃描電鏡結(jié)果顯示各組牙骨質(zhì)表面形貌不同：與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組再礦化后均可見(jiàn)不同程度礦物質(zhì)沉積，以CPP-ACPF組沉積物最厚。能譜分析結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組鈣磷含量均較對(duì)照組明顯升高，各實(shí)驗(yàn)組之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論CPP-ACP及CPP-ACPF均能促進(jìn)脫礦牙骨質(zhì)再礦化，CPP-ACP與氟可能具有協(xié)同抗齲作用。

酪蛋白類；復(fù)合體；氟；牙；牙失礦質(zhì)；牙釉質(zhì)；牙再礦化；牙骨質(zhì)；顯微鏡檢查，電子，掃描

根面齲是老年人及牙周病患者最常見(jiàn)的牙體硬組織疾病，其廣泛流行性及臨床損害的特殊性使治療難度加大且療效不佳，因此根面齲的有效預(yù)防尤為重要。氟化物防齲已有近百年的歷史，作為目前廣泛使用的防齲藥物，其防齲效果已得到各方面認(rèn)可。酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合體（casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate，CPP-ACP）取自牛奶酪蛋白，作為一種新型納米級(jí)生物防齲制劑，具有促進(jìn)脫礦牙體硬組織再礦化、間接抑制致齲菌并干擾致齲菌斑形成等作用［1－3］。已有的研究顯示，CPP-ACP與氟聯(lián)合使用時(shí)具有協(xié)同的抗齲效果。但目前關(guān)于CPP-ACP及氟的抗齲研究多集中于牙釉質(zhì)，二者能否對(duì)根面牙骨質(zhì)發(fā)揮防齲作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以掃描電鏡觀察脫礦牙骨質(zhì)表面應(yīng)用CPP-ACP及氟后的形貌變化，并通過(guò)能譜分析測(cè)定牙骨質(zhì)表面的微區(qū)成分，以明確CPP-ACP及氟促進(jìn)脫礦牙骨質(zhì)再礦化的效果。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 從口腔頜面外科門診要求拔除第三磨牙的患者中選取10名成年人，男性5例，女性5例，年齡（28±6.11）歲（18～40歲），收集10顆完整拔除的新鮮第三恒磨牙（上頜4顆，下頜6顆）。實(shí)驗(yàn)對(duì)象無(wú)系統(tǒng)性疾病，未經(jīng)過(guò)牙周治療，釉牙骨質(zhì)界以下的根面完全被牙齦覆蓋，探診深度≤3mm，無(wú)齲壞及充填物。

1.2 主要材料與儀器GC Tooth Mousse［含10%（w／v）CPP-ACP，日 本 GC 公 司］、GC Tooth Mousse Plus［含10%（w／v）CPP-ACP和0.9g／L氟），日本 GC公司］；高露潔360°牙膏（含氟量1.45g／L）；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（Nova NanoSEM230，美國(guó)FEI公司）；能譜分析儀（INCA x-MAX，英國(guó)OXFORD公司）。

1.3 方法

1.3.1 測(cè)試樣本制備 牙齒拔下后，生理鹽水沖洗，去除表面黏附的血及唾液，2.5%次氯酸鈉浸泡24h除去牙骨質(zhì)表面有機(jī)物。低速渦輪機(jī)流水下去除牙冠、牙根冠1／3、根尖1／3，保留根中1／3，并沿根管縱剖，每牙分為4部分，隨機(jī)納入4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，去離子水中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 脫礦 10顆牙共40個(gè)樣本保留牙骨質(zhì)表面3mm×3mm開(kāi)窗區(qū)，其余部分用抗酸指甲油封閉，浸沒(méi)于脫礦液（0.05mol／L 醋酸，2.2mmol／L氯化鈣，2.2mmol／L 磷酸二氫鉀，pH 4.6）中，37℃持續(xù)脫礦96h［4］，脫礦后流水沖洗。

1.3.3 再礦化實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)共分為4組，空白對(duì)照組、普通含氟牙膏組、CPP-ACP組和 CPP-ACPF組。用小毛刷取用實(shí)驗(yàn)藥品綠豆大小，于牙骨質(zhì)表面反復(fù)涂擦3min，流水沖洗5min，1次／d，共28d。空白對(duì)照組使用去離子水涂擦，普通含氟牙膏組使用含氟量為1.45g／L的高露潔360°牙膏涂擦，CPP-ACP組使用含10%CPP-ACP的 GC Tooth Mousse涂擦，CPP-ACPF組使用含10%CPP-ACP和0.9g／L氟的GC Tooth Mousse Plus涂擦。上述每次操作后將牙骨質(zhì)塊貯存于去人工唾液（按ISO／TR10271標(biāo)準(zhǔn)配制）中，人工唾液每日更換。1.3.4 掃描電鏡觀察及能譜分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組均浸沒(méi)于2.5%次氯酸鈉溶液中，超聲蕩洗10min，流水沖洗5min，10顆牙40個(gè)樣本自然干燥，脫水，噴金，掃描電鏡觀察牙骨質(zhì)塊表面，比較同牙各組牙骨質(zhì)表面的異同；在牙骨質(zhì)表面隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)狀區(qū)域進(jìn)行微區(qū)成分（Ca、P）能譜分析，取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1 牙骨質(zhì)表面形貌 掃描電鏡放大5 000倍下觀察，各組牙骨質(zhì)表面形貌有較大差異：空白對(duì)照組牙骨質(zhì)表面可見(jiàn)大小不等的圓形或橢圓形孔隙，基質(zhì)纖維暴露，輪廓清晰，纖維束交織成網(wǎng)，未見(jiàn)斷裂；普通含氟牙膏組牙骨質(zhì)表面可見(jiàn)礦物質(zhì)沉積，部分脫礦形成的孔隙被遮蓋變小，部分尚未被遮蓋，基質(zhì)纖維輪廓不清；CPP-ACP組牙骨質(zhì)表面礦物沉積質(zhì)將牙骨質(zhì)表面覆蓋，未見(jiàn)脫礦孔隙，基質(zhì)纖維輪廓不清；CPP-ACPF組牙骨質(zhì)表面礦物沉積物最厚，牙骨質(zhì)表面被完全覆蓋，脫礦孔隙和基質(zhì)纖維完全不可見(jiàn)（圖1）。

圖1 掃描電鏡下各組牙骨質(zhì)表面形貌Fig 1 FE-SEMobservation of cementum surfaces of each group

2.2 微區(qū)成分分析 各實(shí)驗(yàn)組牙骨質(zhì)表面Ca、P含量均較對(duì)照組明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各實(shí)驗(yàn)組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組之間Ca／P差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組牙骨質(zhì)表面微區(qū)成分比較Tab 1 The percent of mineral contents of each group

3 討 論

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）是以牛奶酪蛋白為原料，經(jīng)單一酶或復(fù)合酶系水解、分離純化而得到的富含磷酸絲氨酸且具有高度熱穩(wěn)定性和溶解性的生物活性肽［5－6］。CPPs能與鈣磷結(jié)合成復(fù)合體，即酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合體（CPPACP），它是可溶性復(fù)合物，為鈣磷兩種礦物元素的生物可利用形式。若附著在齲損處，則可維持高水平的鈣離子濃度，促使鈣離子進(jìn)入齲損區(qū)，促進(jìn)早期齲損再礦化［7］；并可限制礦物質(zhì)的流失并為后來(lái)的再礦化提供了一個(gè)電勢(shì)源，從而達(dá)到抑制脫礦、促進(jìn)再礦化的作用［8］。其抗齲活性已在實(shí)驗(yàn)室、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中得以證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，使用含10%CPP-ACP的 GC Tooth Mousse，可在脫礦牙骨質(zhì)表面形成礦物質(zhì)沉積物，具有促進(jìn)脫礦牙骨質(zhì)再礦化的作用，說(shuō)明其對(duì)早期根面齲可能具有治療作用。

氟通過(guò)降低釉質(zhì)溶解度和促進(jìn)釉質(zhì)再礦化、對(duì)微生物產(chǎn)生作用以及影響牙的形態(tài)而預(yù)防齲病。氟的抗齲效果依賴于牙齒表面氟離子的局部應(yīng)用，它可通過(guò)羥基置換或溶解羥基磷灰石的再沉淀結(jié)合至羥基磷灰石結(jié)構(gòu)中，形成溶解度更低的氟化物，這是氟防齲的主要因素［9－10］。此外，當(dāng)唾液或菌斑中的鈣磷離子達(dá)到足夠量時(shí)，氟離子可促進(jìn)先前脫礦的組織發(fā)生再礦化。因此局部用氟時(shí)，鈣磷離子的可用性對(duì)于防齲效果至關(guān)重要［11］。由于牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)與釉質(zhì)差別較大，其中無(wú)機(jī)物含量比釉質(zhì)低，而所含有機(jī)基質(zhì)可占組織干重的40%～50%，大大高于牙釉質(zhì)中的1%［12］，因此其再礦化機(jī)制更為復(fù)雜，普通含氟牙膏效果不佳。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，使用含氟量為1.45g／L普通含氟牙膏，雖可見(jiàn)部分礦物質(zhì)沉積，但再礦化明顯不足。因此有學(xué)者認(rèn)為抑制根面齲需要更高濃度的氟［13－14］，因而需要更高濃度的含氟牙膏才能再礦化根齲。目前，國(guó)外用于再礦化根齲的牙膏為含氟量為5g／L的牙膏，但氟所引起的一系列局部和全身的毒副作用使得高濃度氟化物的應(yīng)用受到一定限制。

為避免高濃度氟化物的副作用，發(fā)揮CPP-ACP的生物活性鈣磷儲(chǔ)庫(kù)的優(yōu)勢(shì)，有學(xué)者對(duì)二者的聯(lián)合使用的效果進(jìn)行了研究。Reynolds等在1995年一項(xiàng)鼠齲病模型中證實(shí)CPP-ACP納米復(fù)合物與氟具有協(xié)同效應(yīng)［15］；在2008年的體外實(shí)驗(yàn)中，Reynolds等比較了2%CPP-ACP與不同濃度氟分別使用與聯(lián)合使用的抗齲效果，結(jié)果顯示二者聯(lián)合使用效果更好，進(jìn)一步證實(shí)CPP-ACP與氟具有協(xié)同抗齲效應(yīng)［11］。Cross認(rèn)為CPP在穩(wěn)定鈣磷離子的同時(shí)，還可穩(wěn)定氟離子，CPP-ACP加氟形成酪蛋白磷酸肽鈣氟磷復(fù)合體（CPP-ACFP），其超微結(jié)構(gòu)為半徑（2.12±0.26）nm的無(wú)定形的毫微簇。其中每一個(gè)縮氨酸結(jié)合15個(gè)鈣離子、9個(gè)磷酸根離子和3個(gè)氟離子。此外氟化物局部應(yīng)用后形成的氟磷灰石會(huì)將表面迅速覆蓋，而CPP的存在可阻止磷酸鈣相的迅速形成，離子得以穩(wěn)定并保持活性，從而滲透入表層下病變，促進(jìn)病損整體的再礦化，而不僅局限于表層［16］。王偉萍等在抑制牛牙早期釉質(zhì)齲的體外研究中證實(shí)CPP-ACP能夠減少牙釉質(zhì)脫礦并促進(jìn)再礦化，并與氟化鈉在防齲方面具有協(xié)同作用［17］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，使用含10%CPP-ACP及0.9g／L氟的GC Tooth Mousse Plus，在脫礦牙骨質(zhì)表面形成礦物質(zhì)沉積物最厚，說(shuō)明對(duì)于牙骨質(zhì)，CPP-ACP與氟也具有協(xié)同抗齲作用。

牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及其所處的微生態(tài)環(huán)境決定了其再礦化并非單純的理化進(jìn)程，牙菌斑及其中微生物發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。大量研究顯示CPP-ACP的局部應(yīng)與牙菌斑生物膜密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，CPPs可被免疫定位在細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞間基質(zhì)中，可誘導(dǎo)口內(nèi)生物膜的延遲形成，并通過(guò)選擇性抑制產(chǎn)生非致齲性牙菌斑，此外，還有可能通過(guò)提高游離鈣的濃度，產(chǎn)生額外的抗菌斑效果［8，18－20］。CPP-ACP的每種潛在的作用模式（抑制脫礦，促進(jìn)再礦化，減少黏附，抑菌／殺菌作用）均與氟的作用一一對(duì)應(yīng)，兩者聯(lián)合應(yīng)用的效果有待深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)條件下單獨(dú)使用10%CPPACP或單獨(dú)用1.45g／L氟，均可促進(jìn)脫礦牙骨質(zhì)表面礦物質(zhì)沉積，兩者合用效果最優(yōu)，CPP-ACP與氟可能具有協(xié)同抗齲作用。但本實(shí)驗(yàn)尚未將微生物因素納入研究范圍，今后將進(jìn)一步研究牙菌斑生物膜對(duì)CPP-ACP及氟對(duì)牙骨質(zhì)發(fā)揮再礦化作用的影響，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

［1］Altenburger MJ，Gmeiner B，Hellwig E，etal.The evaluation of fluorescence changes after application of casein phosphopeptides（CPP）and amorphous calcium phosphate（ACP）on early carious lesions［J］.AmJDent，2010，23（4）：188-192.

［2］Rahiotis C，Vouqiouklakis G.Effect of a CPP-ACP agent on the demineralization and remineralization of dentineinvitro［J］.JDent，2007，35（8）：695-698.

［3］張 瓊，鄒 靜.酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合體在牙菌斑中的作用［J］.國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，35（增刊）：49-52.

［4］劉紅春，俞少杰，胡德渝.不同濃度含氟牙膏再礦化根面齲的體外實(shí)驗(yàn)［J］.上?？谇会t(yī)學(xué)，2010，19（6）：653-657.

［5］Gapparov MM，Stan Ela.Effect of casein phosphopeptides on bioavailability of the alimentary minerals［J］.VoprPitan，2003，72（6）：40-44.

［6］徐 皚，劉興榮.酪蛋白磷酸肽生物活性及其防齲作用［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè)，2005，32（5）：333-335.

［7］Reynolds E C.Anticariogenic complexes of amorphous calcium phosphate stabilized by casein phosphopeptides：a review.［J］.SpecCareDetist，1998，18（1）：8-16.

［8］Reynolds EC，Cai F，Shen P，etal.Retention in plaque and remineralization of enamel lesions by various forms of calcium in a mouthrinse or sugar-free chewing gum ［J］.JDentRes，2003，82（3）：206-211.

［9］Ten Cate JM.Current concepts on the theories of the mechanism of action of fluoride［J］.JActaOdontolScand，1999，57（6）：325-329.

［10］Lynch R J，Navada R，Walia R.Low-levels of fluoride in plaque and saliva and their effects on the demineralization and remineralisation of enamel：role of fluoride toothpastes［J］.IntDentJ，2004，54（5Suppl 1）：304-309.

［11］Reynolds E C，Cai F，Cochrane N J，etal.Fluoride and casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate ［J］.J DentRes，2008，87（4）：344-348.

［12］彭志翔，樊明文，邊 專，等.膠原酶在人工根面齲樣損害中作用的超微結(jié)構(gòu)研究［J］.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2002，18（2）：86-87.

［13］Lynch E，Baysab A.Reversal of primary root caries using a dentifrice with a high fluoride content ［J］.CariesRes，2001，35（Suppl 1）：60-64.

［14］Herkstroter F M，Witjes M，Arends J.Demineralization of human dentin compared with enamel in a pH-cycling apparatus with a constant composition during de-and remineralization periods［J］.CariesRes，1991，25（5）：317-322.

［15］Reynolds E C，Cain CJ，Webber F L，etal.Anticariogenicity of calcium phosphate complexes of tryptic casein phosphopeptides in the rat［J］.JDentRes，1995，74（6）：1272-1279.

［16］Cross K J，Huq N L，Stanton D P，etal.NMR studies of a novel calcium，phosphate and fluoride delivery vehicle-alpha（S1）-casein（59-79）by stabilized amorphous calcium fluoride phosphate nanocomplexes［J］.Biomaterials，2004，25（20）：5061-5069.

［17］王偉萍，盧友光，馮 巖.酪蛋白磷酸肽－磷酸鈣溶液抑制牛牙早期釉質(zhì)齲的體外研究［J］.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，45（6）：414-417.

［18］Rahiotis C，Vougiouklakis G，Eliades G.Characterization of oral films formed in the presence of a COO-ACP agent：an in situ study［J］.JDent，2008，36（4）：272-280.

［19］Sch pbach P，Neeser J R，Golliard，etal.Incorporation of caseinoglycomacropeptide and caseinophosphopeptide into the salivary pellicle inhibits adherence of mutans streptococci［J］.JDentRes，1996，75（10）：1779-1788.

［20］Trombe MC，Clav C，Manias J M.Calcium regulation of growth and differentiation in Streptococcus pneumoniae［J］.JGenMicrobiol，1992，138（1）：77-84.

（編輯：何佳鳳）

Remineralization of Artificial Demineralized Cementum by CPP-ACP and Fluoride Dentifriceinvitro

MA Zhongxiong，LU Youguang，LU Guoying
School and Hospital of Stomatology，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350002，China

ObjectiveTo assess and compare the effect of fluoride dentifrices，CPP-ACP and CPP-ACPF in remineralization of artificial demineralized cementum.MethodsSound human cementum fragments obtained from the third molar were stored in a demineralization solution for 96hat 37℃to induce artificial demineralization lesions. The fragments were then randomly divided into four treatment groups including control group，fluoride dentifrices group，CPP-ACP group and CPP-ACPF group. The demineralized samples were treated with different material for 3min per day. After 28days the samples were evaluated using field emission-scanning electron microscopy（FE-SEM）. The SEMobservations revealed different morphological features brought about by CPP-ACP，and the energy spectrometry analysis was used to measure the mineral contents in cenentum （Ca，P，Ca／P）. The data was analyzed using ANOVA with SPSS17.0software package.. ResultsDifferent thickness deposits of mineral were observed in each group except the control one，and the thickest were observed in CPP-ACPF group. The mineral contents were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）.Conclusions CPPACP and fluoride are all effective in remineralizing artificial demineralized cementum. CPP-ACP and fluoride have synergistic effect in caries prevention.

compomers；caseins；fluorine；tooth；tooth demineralization；dental enamel；tooth remineralization；dental cementum microscopy，electron，scanning

R319.3；R446.8；R780.1；R781.1

A

1672-4194（2014）01-0038-04

2013-12-30

福建省自然科學(xué)基金（2010J01161）；福建省教育廳課題（JB12126）

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬口腔醫(yī)院黏膜科，福州 350002

馬忠雄（1972－），男，副主任醫(yī)師，副教授，醫(yī)學(xué)碩士

盧友光.Email：fjlyg63＠163.com

讀者－作者－編者