尿酸對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2纖維化相關(guān)調(diào)控因子的影響

陳繼承，康 潔，高碧珍，廖凌虹，丁珊珊

尿酸對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2纖維化相關(guān)調(diào)控因子的影響

陳繼承，康 潔，高碧珍，廖凌虹，丁珊珊

目的觀察不同濃度尿酸對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）相關(guān)纖維化調(diào)控因子的影響，探討建立尿酸誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞纖維化模型，為尿酸性腎纖維化疾病的研究提供細(xì)胞模型。方法以不同濃度的尿酸刺激 HK-2細(xì)胞6，12，24，36h，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性抑制率；Real-Time PCR檢測(cè)TGF-β1、CTGF、α-SMA mRNA的表達(dá)，觀察尿酸對(duì)HK-2細(xì)胞的促纖維化作用；26mg／dL濃度尿酸刺激HK-2細(xì)胞24h，免疫組織化學(xué)檢測(cè)TGF-β1、CTGF、α-SMA蛋白的改變。結(jié)果尿酸刺激后細(xì)胞活性抑制率與對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.05），呈時(shí)間依賴性；尿酸刺激后TGF-β1、CTGF、α-SMA的表達(dá)量與對(duì)照組比較明顯增加（P＜0.05），并呈劑量依賴性；尿酸刺激后TGF-β1、CTGF、α-SMA蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組比較明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論尿酸可抑制 HK-2細(xì)胞增殖；采用尿酸誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞，可建立腎纖維化的細(xì)胞模型。

尿酸；上皮細(xì)胞；腎小管；纖維化；免疫組織化學(xué)；聚合酶鏈反應(yīng)

隨著生活水平提高，高尿酸血癥的發(fā)病率逐年遞增。當(dāng)尿酸長(zhǎng)期沉積于腎臟，可造成腎實(shí)質(zhì)損害，最終導(dǎo)致腎纖維化。目前腎纖維化動(dòng)物模型較多，而細(xì)胞模型較少，建立合適的腎纖維化細(xì)胞模型，對(duì)進(jìn)一步研究高尿酸血癥所致的腎纖維化的機(jī)制和防治，具有積極的意義。在高尿酸血癥最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程中有多種纖維化因子，如轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth activator protein，α-SMA）參與其中。本實(shí)驗(yàn)擬觀察不同濃度尿酸對(duì)腎小管上皮細(xì)胞相關(guān)纖維化調(diào)控因子表達(dá)水平的影響，探討建立腎纖維化的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑 人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞，美國(guó) ATCC 細(xì)胞庫(kù)）。尿酸 （批號(hào)：STBC0525V，美國(guó)Sigma公司）；MTT（批號(hào)：M2128，美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清（批號(hào)：911585，美國(guó)Gibco公司）；Trizol RNA抽提試劑（批號(hào)：9108，日本TaKaRa公司）；SYBR Green PCR Master mix（批號(hào)：RR420A，日本TaKaRa公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：FSQ-201，日本 TOYOBO公司）；TGF-β1、CTGF、α-SMA、β－肌動(dòng)蛋白（β-actin）引物（上海生工生物 工 程 有 限 公 司）；兔 抗 人 TGF－β1、CTGF、α-SMA抗體（批號(hào)：bs-0103R，北京博士德公司）。

1.1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱（150型，美國(guó) Thermo公司）；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；倒置熒光相差顯微鏡（Ti-S型，日本尼康公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（epgradient型，德國(guó)Eppendorf公司）；連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200F200型，奧地利TECAN公司）。

1.2 方法

1.2.1 HK-2細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100U／mL 青霉素和 100μg／mL 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3d換液1次，至細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%匯合后進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均為第3～5代細(xì)胞。取匯合達(dá)80%的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化制成細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步處于G0期。

取培養(yǎng)后同步處于G0期的HK-2細(xì)胞，按繼續(xù)培養(yǎng)條件的不同分為4組：（1）對(duì)照組：僅使用RPMI 1640；（2）U1組：RPMI 1640＋10mg／dL尿酸；（3）U2組：RPMI 1640＋21mg／dL尿酸；（4）U3組：RPMI 1640＋26mg／dL尿酸。每組均培養(yǎng)4瓶細(xì)胞。上述細(xì)胞在不同培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)6，12，24，36h，到達(dá)相應(yīng)時(shí)間后用胰酶消化，離心后抽提總RNA。每個(gè)時(shí)間段均重復(fù)6次。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 常規(guī)消化收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HK-2細(xì)胞，按每孔104接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，換成無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于G0期，按上述分組情況各加入200μL培養(yǎng)基。另設(shè)空白對(duì)照孔：只加完全培養(yǎng)基（不加細(xì)胞，用于調(diào)零）。每種濃度設(shè)9個(gè)復(fù)孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)6，12，24，36h后，每孔去原培養(yǎng)液后加入100μL（0.5mg／mL）MTT，37℃孵育4h，棄除MTT，然后每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩約10min，溶解形成的結(jié)晶，在492nm波長(zhǎng)處，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，空白對(duì)照孔調(diào)零。以上各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 HK-2細(xì)胞總RNA抽提及cDNA制備 應(yīng)用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。反應(yīng)體系如下：2μg模板RNA，65℃熱變性5min，立即置于冰上冷卻，加入4μL的5×RT Master Mix，加入 Nuclease-free Water至終體積20μL。反應(yīng)參數(shù)如下：37℃15min→52℃5min→98℃5min。－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Real-time PCR 擴(kuò) 增 TGF-β1、CTGF、α-SMA、β-actin基因引物序列見(jiàn)表1。采用看家基因β-actin進(jìn)行標(biāo)化。取同一個(gè)cDNA為模板進(jìn)行TGF-β1、CTGF、α-SMA、β-actin的 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：2μL cDNA，12.5μL 2×SYBR Green PCR Master mix試劑，0.5μL引物，加超純水至終體積25μL。反應(yīng)參數(shù)如下：95℃30s→95℃5s→60℃30s，40個(gè)循環(huán)，得出各反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和Ct值。采用相對(duì)定量2－△△Ct法比較各基因的表達(dá)差異［1］。以對(duì)照組表達(dá)量為1，2－△△Ct值即為尿酸干預(yù)后較對(duì)照組基因表達(dá)的倍數(shù)。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.5 細(xì)胞免疫組織化學(xué) 將清潔滅菌蓋玻片置于6孔板中，每孔接種細(xì)胞懸液（105／mL）2mL，培養(yǎng)24h后，換成無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后將細(xì)胞分成對(duì)照組和含26mg／dL尿酸組，繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出細(xì)胞爬片，用PBS漂洗，2min×3次。4%多聚甲醛室溫固定20min后進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)。簡(jiǎn)要染色步驟如下：0.5%TritionX-100室溫處理20min，PBS漂洗后，3%H2O2室溫孵育10min

2 結(jié) 果

2.1 尿酸對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的尿酸（0，10，21，26mg／dL）刺激 HK-2細(xì)胞6，12，24，36h后，與對(duì)照組比較，尿酸刺激后細(xì)胞活性抑制率均有明顯上升。其中在同一作用時(shí)間下，隨著尿酸濃度增加，細(xì)胞活性抑制率呈劑量依賴性逐步增加；在同一濃度作用下，隨著作用時(shí)間增加，中高濃度細(xì)胞活性抑制率呈時(shí)間依賴性逐步增加，低濃度先增高后降低?？梢?jiàn)尿酸對(duì)HK-2細(xì)胞的作用呈劑量依賴性（圖1）。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性，PBS漂洗，檸檬酸高溫抗原修復(fù)，正常山羊血清孵育20min封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)，兔抗人TGF－β1、CTGF、α-SMA抗體工作液4℃過(guò)夜，PBS漂洗后相繼與二抗及SABC試劑各孵育20min，PBS漂洗，DAB顯色和蘇木素復(fù)染，乙醇梯度脫水后中性樹(shù)膠封片。顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件測(cè)量區(qū)域內(nèi)積分光密度平均值。

圖1 尿酸對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響Fig 1 The influence of uric acid in HK -2cell proliferation

2.2 尿酸對(duì) HK-2細(xì)胞 TGF-β1、CTGF、α-SMA mRNA表達(dá)的影響

2.2.1 尿酸對(duì) HK-2細(xì)胞 TGF－β1mRNA 表達(dá)的影響 不同濃度尿酸刺激6，12，24h后，各組HK－2細(xì)胞TGF－β1mRNA表達(dá)持續(xù)上調(diào)；36h后表達(dá)有所降低，但仍高于對(duì)照組。24h時(shí)中高濃度作用差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（vs其他組，P＜0.05），其他時(shí)間段不同濃度之間作用差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 尿酸對(duì) HK-2細(xì)胞 TGF-β1mRNA 表達(dá)的影響（2－△△Ct）Tab 2 The effect of uric acid on HK-2cells expression of TGF－β1mRNA（2－△△Ct）

2.2.2 尿酸對(duì)HK-2細(xì)胞CTGF mRNA表達(dá)的影響 不同濃度尿酸培養(yǎng)不同時(shí)間后的各組HK-2細(xì)胞CTGF mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組；隨時(shí)間增加，CTGF mRNA表達(dá)先增高后降低；24h時(shí)高濃度作用差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（vs中低濃度，P＜0.05），其他時(shí)間段不同濃度之間作用差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

表3 尿酸對(duì)HK-2細(xì)胞CTGF mRNA表達(dá)的影響（2－△△Ct）Tab 3 The effect of uric acid on HK-2cells expression of CTGF mRNA（2－△△Ct）

2.2.3 尿酸對(duì) HK-2細(xì)胞α-SMA mRNA 表達(dá)的影響 不同濃度尿酸刺激不同時(shí)間后的各組HK-2細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)水平均高于正常組；隨著時(shí)間增加，中低濃度（10，21mg／dL）α-SMA mRNA表達(dá)隨時(shí)間增加而升高，而高濃度（26mg／dL）隨時(shí)間增加而先升高后降低；24h時(shí)高濃度作用差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（vs中低濃度，P＜0.05），其他時(shí)間段不同濃度之間作用差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表4）。

2.3 26mg／dL 尿 酸 對(duì) HK-2 細(xì) 胞 TGF-β1、CTGF、α-SMA蛋白表達(dá)的影響 TGF-β1、CTGF、α-SMA均表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)中。26mg／dL尿酸培養(yǎng)24h后 TGF-β1、CTGF、α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著增高（vs對(duì)照組，P＜0.01，表5，圖2）。

表4 尿酸對(duì) HK-2細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)的影響（2－△△Ct）Tab 4 The effect of uric acid on HK-2cells expression of α-SMA mRNA（2－△△Ct）

表5 26mg／dL尿酸對(duì) HK-2細(xì)胞 TGF-β1、CTGF、α-SMA蛋白表達(dá)的影響（IOD）Tab 5 The effect of uric acid on HK-2cells expression of TGF-β1，CTGF，α-SMA protein（IOD）

圖2 各組 TGF－β1、CTGF、α-SMA 蛋白表達(dá)的比較（ ×400）Fig 2 The comparison of TGF-β1，CTGF，α-SMA protein expression（ ×400）

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是各類腎臟疾病進(jìn)入終末期腎衰的共同途徑，在腎臟疾病的預(yù)后轉(zhuǎn)歸中起著重要作用［2］。近年來(lái)，腎間質(zhì)纖維化日益得到眾多研究者的重視。腎纖維化主要與間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增生及細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度堆積有關(guān)。Strutz等于1995年首先證實(shí)腎小管上皮細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)化為間質(zhì)成纖維細(xì)胞，是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機(jī)制之一［3－4］。許多細(xì)胞因子參與腎纖維化，其中TGF－β1是眾多因子中最關(guān)鍵的促纖維化因子［5］，參與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的各個(gè)環(huán)節(jié)。CTGF是TGF－β1引起的即刻早期基因表達(dá)的產(chǎn)物，是TGF－β1促纖維化活性的下游信號(hào)分子之一。研究表明，CTGF通過(guò)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，參與腎纖維化的形成［6］。肌成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)中合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，特異性的表達(dá)α-SMA。楊麗霞等研究證實(shí)，正常的HK-2細(xì)胞不表達(dá)α-SMA，而在向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程中高度表達(dá)α-SMA［7］。因此α-SMA表達(dá)的增多是腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的指示性標(biāo)志物。

尿酸主要經(jīng)腎臟排泄。當(dāng)尿酸長(zhǎng)期在腎小管間質(zhì)內(nèi)沉積，將導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷、激發(fā)炎癥反應(yīng)，最終發(fā)生腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化等病變。一些離體實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，尿酸可促進(jìn)人腎小管上皮細(xì)胞尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子、細(xì)胞間黏附分子-1、纖維化相關(guān)因子和基質(zhì)成分的表達(dá)［8－10］。

目前腎纖維化細(xì)胞模型較少，主要采用TGF－β誘導(dǎo)建立。本研究采用4倍生理濃度尿酸依次進(jìn)行0.8，0.4倍稀釋，刺激體外培養(yǎng)的 HK-2細(xì)胞不同時(shí)間（6，12，24，36h），以模擬高尿酸環(huán)境。結(jié)果顯示，尿酸能抑制HK-2細(xì)胞活性，通過(guò)上調(diào)纖維化相關(guān)因子（TGF-β1、CTGF、α-SMA）的表達(dá)，促進(jìn)HK－2細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。因此，筆者認(rèn)為采用26mg／dL濃度的尿酸干預(yù)HK-2細(xì)胞24h，可以建立腎纖維化的細(xì)胞模型。該模型的建立，將對(duì)高尿酸血癥導(dǎo)致的腎纖維化的產(chǎn)生機(jī)制和藥物的防治研究提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

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（編輯：張慧茹）

Effect of Uric Acid on Expression of Fibrosis-related Regulatory Factors in HK-2 Cells

CHEN Jicheng，KANG Jie，GAO Bizhen，LIAO Linghong，DING Shanshan

Fujian University of TCM，College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China

ObjectiveTo observe the effect of different concentrations of uric acid（UA）on expression of fibrosis-related regulatory factors in human renal tubular epithelial cells（HK-2），and to establish UA-induced fibrosis model in HK-2cells for study of renal fibrosis diseases.MethodsHK-2cells were exposed to increasing concentrations of UA for 6h，12h，24h，36h，respectively，and the cell viability was determined by MTT assay. Real-Time PCR were employed to investigate the mRNA expression of TGF-β1，CTGF，andα-SMA. The protein levels of TGF-β1，CTGF，andα-SMA were evaluated by immunohistochemistry on HK-2cells exposed to UA for 24h.. ResultsMTT assay showed that UA could induce marked decrease of cell viability in a time-dependent manner as compared with the untreated control cells（P＜0.05）. The mRNA levels of TGF-β1，CTGF andα-SMA were increased time-dependently when HK-2cells were treated with with UA（P＜0.05）. The protein levels of TGF-β1，CTGF and α-SMA were increased significantly in HK-2cells treated with 26mg／dL UA for 24h（P＜0.05）.ConclusionUA could inhibit HK-2cell proliferation and the cells model of renal fibrosis could be established by UA induction.

uric acid；epithelial cells；kidney tubules；fibrosis；immunohistochemistry；polymerase chain reaction

R322.61；R329.24；R341.32；R392.11；R446.1；R589.7

A

1672-4194（2014）01-0025-04

2013-10-27

福建省自然科學(xué)基金（2011J01208），福建省教育廳A類科技重點(diǎn)項(xiàng)目（JA11129）

福建中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350122

陳繼承（1988－），男，福建中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)碩士研究生

高碧珍.Email：gbz688＠163.com