苦菊提取物對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及其安全性致突變作用的研究

陳超杰，史 蕤，展麗娟，魏金鋒，靳洪濤，秦海林，王愛平

苦菊提取物對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及其安全性致突變作用的研究

陳超杰1，史 蕤2，展麗娟3，魏金鋒4，靳洪濤4，秦海林5，王愛平2

目的考察苦菊提取物對(duì)肝損傷的影響及其致突變作用。方法通過噻唑藍(lán)（MTT）法和2，7-二氯二氫熒光素乙酰乙酸（DCFH-DA）熒光染色，檢測(cè)苦菊提取物對(duì)2，2’-偶氮－雙-（2-脒基丙烷）氯化二氫（AAPH）致HepG2細(xì)胞損傷的存活率以及胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的影響；建立四氯化碳（CCl4）致小鼠肝急性損傷模型，以觀察苦菊提取物對(duì)急性肝損傷小鼠的肝組織病理變化和血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平的影響；以鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變（Ames）試驗(yàn)檢測(cè)苦菊提取物的致突變作用。結(jié)果AAPH處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞存活率下降，胞內(nèi)ROS水平上升，而加入不同濃度的苦菊提取物則可明顯改善上述結(jié)果；苦菊提取物能改善CCl4致小鼠肝急性損傷的肝細(xì)胞壞死和炎癥病變，并可降低血清中ALT和AST水平，呈劑量依賴趨勢(shì)，提示苦菊提取物具有肝保護(hù)的作用；苦菊提取物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌株無(wú)致基因突變作用。結(jié)論苦菊提取物具有良好的肝保護(hù)作用，并初步判斷其毒性不明顯，且無(wú)致突變作用。

菊花；植物提取物；肝；乙酸鹽類；細(xì)胞，培養(yǎng)的；疾病模型，動(dòng)物

苦菊又名栽培菊苣、苦苣。研究認(rèn)為，苦菊含有抗氧化活性的營(yíng)養(yǎng)成分，因此它一直被認(rèn)為是一種健康食品［1］。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作發(fā)現(xiàn)，苦菊提取物不僅具有清除自由基和抗氧化的作用，并且對(duì)叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，t-BHP）所致的肝損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗氧化作用有關(guān)［2－3］。本研究擬通過不同的促自由基生成劑觀察苦菊提取物在細(xì)胞和動(dòng)物水平對(duì)肝損傷的作用，進(jìn)一步確證其肝保護(hù)的功效；通過鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變（Ames）試驗(yàn)檢測(cè)苦菊提取物的致突變作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 提取物制備 苦菊購(gòu)自北京新發(fā)地蔬菜批發(fā)中心，經(jīng)鑒定為菊科菊苣屬植物苦菊。配備過程如下：苦菊干燥全草5.8kg經(jīng)95%乙醇回流提取3次（80L×2h、70L×1h、68L×1h），過濾合并濾液，減壓濃縮所得浸膏混懸于70%乙醇溶液中?；鞈乙豪^續(xù)經(jīng)石油醚萃取4次（2，1.5，1.5，1.5L），所得到的乙醇層經(jīng)減壓濃縮至無(wú)醇味，加水混懸約并經(jīng)乙酸乙酯萃取3次 （1.5，1.2，1.2L），萃取后所得的水層約2.2L，過大孔吸附樹脂，其中60%乙醇部分濃縮后揮干得到重約40g的棕色粉狀顆粒，即為苦菊提取物，苦菊提取物的化學(xué)成分分析參考文獻(xiàn)［3］。用于體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，每次稱取適當(dāng)樣品用不含血清的培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，0.22μm濾膜過濾后使用；用于體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)，稱取適當(dāng)樣品用生理鹽水配至所需濃度后使用。

1.1.2 試劑 2，2’-偶氮－雙-（2-脒基丙烷）氯化二氫（AAPH）、噻唑藍(lán)（MTT）、2，7-二氯二氫熒光素乙酰 乙 酸 （DCFH-DA）、4-硝 基 喹 啉 氮 氧 化 物（4-NQO）、疊氮鈉（NaN3）為美國(guó)Sigma-Aldrich公司；絲裂霉素C（MMC，瑞士Roche公司）；2-氨基芴（2-AF，德國(guó) Merck公司）；環(huán)磷酰胺（CP，美國(guó) Alfa公司）；聯(lián)苯雙酯（批號(hào)：09020209，北京協(xié)和藥廠）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)試盒（ALT，南京建成生物工程研究所），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒（AST，南京建成生物工程研究所）。其他化學(xué)試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 動(dòng)物 健康雄性ICR小鼠48只，體質(zhì)量18～20g，清潔級(jí)［北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0007］。健康雄性Wistar大鼠180～220g，清潔級(jí)［北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0007］。

1.1.4 儀器 酶標(biāo)儀（Spectra Max190，美國(guó) Molecular Devices公司）；熒光酶標(biāo)儀（Spectra Max Gemini XS，美國(guó) Molecular Devices公司）；熒光倒置顯微鏡（IX-70，日本 Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞氧化損傷試驗(yàn)

1.2.1.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)及處理 HepG2細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所李燕教授提供。采用含10%小牛血清（FCS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，每2d換液1次，6d傳代1次。

1.2.1.2 分組處理 空白對(duì)照組加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液；模型組加入含AAPH（終濃度為10mmol／L）的無(wú)血清培養(yǎng)基；治療組的處理與模型組一樣并分別加入12.5，25，50，100mg／L的苦菊提取物。

1.2.1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化液消化細(xì)胞后，用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液調(diào)至1×105mL－1，接種于96孔板內(nèi)，每孔100μL。每組6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。按以上1.2.1.2進(jìn)行分組處理，并繼續(xù)培養(yǎng)3h，加入 MTT（終濃度為5g／L），繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上清加入200μL DMSO，吹打均勻，在酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)545nm處測(cè)定OD值。細(xì)胞的存活率＝［1－（ODs／ODc）］×100%。其中，ODs為待測(cè)樣品組OD值，ODc為空白對(duì)照組OD值。

1.2.1.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化液消化細(xì)胞后，用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液調(diào)至1×106mL－1，接種于6孔板內(nèi)，每孔2mL。置于37℃、體積分為數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。按1.2.1.2進(jìn)行分組處理，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，在檢測(cè)前30min加入DCFH-DA（終濃度為50μmol／L）。檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞換液為2mL的PBS，在激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530nm的熒光酶標(biāo)儀中檢測(cè)熒光強(qiáng)度值，并隨后于熒光倒置顯微鏡中拍照。

1.2.2 小鼠急性肝損傷試驗(yàn)

1.2.2.1 動(dòng)物分組、給藥及CCl4急性肝損傷模型的建立 方法參照文獻(xiàn)［4］。48只ICR小鼠檢疫5d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成6組，即正常對(duì)照組、CCl4模型組、苦菊提取物150，300，600mg／kg 3個(gè)處理組、聯(lián)苯雙酯150mg／kg處理組，每組8只。聯(lián)苯雙酯處理組和苦菊提取物處理組均按0.2mg／10g體質(zhì)量的給藥量經(jīng)口灌胃給藥，正常對(duì)照組和CCl4模型組以等體積生理鹽水灌胃給藥，1次／d，連續(xù)7d。末次給藥后1h，除正常對(duì)照組外，其他各組小鼠按10mL／kg劑量腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液，正常對(duì)照組腹腔注射同體積花生油。禁食24h后稱體質(zhì)量，摘眼球收集血液，以2 500r／min離心15min后收集上清，得到待測(cè)血清，－20℃保存待測(cè)。頸椎脫臼處死小鼠后，迅速取出肝臟進(jìn)行病理切片制作的處理。

1.2.2.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 取小鼠血清檢測(cè)AST和ALT，具體檢測(cè)方法參考南京建成試劑盒說明書。1.2.2.3 病理學(xué)檢查 將肝組織浸泡于事先配好的福爾馬林溶液（10%的甲醛溶液）中固定，石蠟包埋切片。常規(guī)H-E染色，染色步驟包括：（1）切片脫蠟，水化；（2）蘇木素染色5min；（3）1%鹽酸－乙醇分化后流水沖洗30min；（4）1%H-E染色3min，蒸餾水清洗；（5）切片梯度乙醇脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片。切片于正置顯微鏡下觀察并拍攝照片。

1.2.3 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

1.2.3.1 大鼠S9活化系統(tǒng)的制備 采用苯巴比妥鈉和β－奈黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)方法，Wistar大鼠腹腔注射誘導(dǎo)劑，5d后安樂死處理大鼠，75%乙醇皮毛消毒，開腹取出肝臟稱質(zhì)量。將肝組織剪碎后，用KCl溶液（0.15mol／L）洗滌4～5次。以每克肝質(zhì)量加3mL KCl溶液（0.15mol／L）的比例將肝組織放入勻漿器中制成勻漿，9 000g離心10min，取其上清液（S9）分裝塑料管（2mL／管）。－80℃冰箱冷凍保存。S9混合液的組成：每毫升S9混合液組成如表1，S9混合液現(xiàn)用現(xiàn)配。

表1 每毫升S9混合液中各組分含量Tab 1 Contents of components in S9mixture per milliliter

1.2.3.2 菌株來源與特性 鼠傷寒沙門氏菌TA97，TA98，TA100，TA102，TA1535來自 Krishgen Biosystems，以上5株測(cè)試菌株除具有組氨酸合成缺失突變外，還具有細(xì)胞壁脂多糖缺失突變，除TA1535外其余4株均含有抗性R因子。另外，TA97，TA98，TA1535和TA100四菌株還具有切除修復(fù)系統(tǒng)缺失突變（紫外線敏感），而TA102則具有四環(huán)素抗性因子。鑒定結(jié)果滿足上述遺傳特性要求的菌株用于試驗(yàn)。菌株平時(shí)在液氮冷凍保存，實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)菌接種在肉湯培養(yǎng)液中，37℃空氣振蕩（100～120r／min）條件下連續(xù)培養(yǎng)約12h后使用。

1.2.3.3 藥物與對(duì)照品的配制

1.2.3.3.1 藥物配制 取苦菊提取物用DMSO配制為50mg／mL的溶液，梯度稀釋為試驗(yàn)所需濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3.3.2 直接誘變劑的配制 MMC（1.0μg／皿）用生理鹽水配制成0.25mg／mL的溶液，4-NQO（2.0g／皿）用 DMSO 配制成0.2mg／mL的溶液，NaN3（1.5μg／皿）用蒸餾水配制成0.15mg／mL的溶液，以上三者皆無(wú)菌分裝，置－20℃冰箱保存，臨用前稀釋成所需濃度溶液。

1.2.3.3.3 間接誘變劑的配制 2-AF（60.0μg／皿）用DMSO配制成6mg／mL的溶液，CP（200.0μg／皿）用生理鹽水配制成20mg／mL的溶液，以上兩者無(wú)菌分裝，置－20℃冰箱保存，臨用前稀釋成所需濃度溶液。

1.2.3.4 抑菌試驗(yàn)和給藥劑量 取苦菊提取物（劑量為5 000，2 500，1 000，400，200，100，50μg／皿）加入鑒定合格的TA100菌株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，確定待測(cè)樣品的試驗(yàn)劑量。抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，各劑量組均未見明顯抑菌作用，因此確定苦菊提取物的測(cè)試劑量為5 000.0，500.0，50.0，5.0，0.5μg／皿。

1.2.3.5 對(duì)照組設(shè)置 試驗(yàn)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照（DMSO）及陽(yáng)性誘變劑對(duì)照。直接誘變劑為2.0μg／皿4-NQO（作用于 TA97，TA98菌株），1.5μg／皿 NaN3（作用于 TA100，TA1535菌株），1.0μg／皿 MMC（作用于TA102菌株），間接誘變劑為60.0μg／皿 2-AF（作用于 TA97，TA98，TA100，TA102菌株），200.0μg／皿CP（作用于TA1535菌株）。1.2.3.6 測(cè)試方法 采用平皿摻入預(yù)培養(yǎng)法。將0.1mL待測(cè)樣品溶液或溶媒、0.1mL增菌液和0.5mL PBS（pH 7.4，0.2mol／L）或再加入0.5mL S9混合液加入無(wú)菌試管（15×150mm）內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)20min，振蕩頻率約120r／min。然后向試管中加入2mL融化的頂層瓊脂（頂層瓊脂加入前維持在45℃水浴中）。振蕩混懸管中成份后，鋪至基礎(chǔ)培養(yǎng)基平皿表面。待頂層瓊脂凝固后，將平皿倒置放入培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)約48h。每次測(cè)試濃度在活化和非活化條件下各做3個(gè)平皿，重復(fù)試驗(yàn)1次。顯微鏡下確認(rèn)細(xì)菌背景菌苔生長(zhǎng)良好，與空白對(duì)照比較無(wú)明顯稀疏的條件下進(jìn)行回變菌落計(jì)數(shù)，采用手工計(jì)數(shù)。在確認(rèn)細(xì)菌背景生長(zhǎng)良好的條件下，計(jì)數(shù)回變菌落數(shù)。如受試樣品引起的回變菌落數(shù)超過空白對(duì)照1倍以上，并有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，判斷待測(cè)樣品誘變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性，反之則為陰性。

2 結(jié) 果

2.1 苦菊提取物對(duì)受損HepG2細(xì)胞的影響

2.1.1 MTT 檢 測(cè) 細(xì) 胞 活 性 40mmol／L 的AAPH處理HepG2細(xì)胞3h后，能引起HepG2細(xì)胞損傷，即模型組細(xì)胞的存活率下降至75.11%（P＜0.05vs空白對(duì)照組）?？嗑仗崛∥锟捎行Х乐笰APH對(duì)HepG2細(xì)胞的損傷，濃度為50和100mg／L的苦菊提取物皆能提高細(xì)胞的存活率（P＜0.01vs模型組），并呈濃度依賴的趨勢(shì)（表2）。

2.1.2 DCFH-DA熒光染色法檢測(cè)胞內(nèi)ROS水平DCFH-DA能進(jìn)入HepG2細(xì)胞內(nèi)，與胞內(nèi)活性氧氧化成有熒光的DCF。40mmol／L的AAPH處理HepG2細(xì)胞1h后，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度顯著增加（P＜0.01vs空白對(duì)照組）。而加入不同濃度的苦菊提取物后，則可顯著降低受損HepG2細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度（P＜0.01vs模型組），并呈濃度依賴的趨勢(shì)（圖1，表2）。

2.2 苦菊提取物對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的影響

2.2.1 肝組織病理學(xué)檢查 鏡下觀察各組動(dòng)物肝組織切片，可見空白對(duì)照組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)清晰可辨，核膜清晰、核大而圓；模型組小鼠肝細(xì)胞大片壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；苦菊提取物低、中劑量處理組小鼠肝細(xì)胞壞死減輕，可見點(diǎn)狀壞死，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)程度減輕；苦菊提取物高劑量處理組的肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，壞死和炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)不明顯（圖2）。

2.2.2 血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè) 空白對(duì)照組血清ALT、AST水平明顯低于模型組（P＜0.01），說明急性肝損傷造模成功。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組與苦菊提取物治療組的ALT、AST水平均顯著降低（P＜0.05，表3）。

表2 苦菊提取物對(duì)受損HepG2細(xì)胞的存活率和ROS水平的影響Tab 2 Effect of Cichoriumendivia L.extract on survival rate and ROS level in injured HepG2cells

圖1 DCFH-DA熒光染色后HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的變化（ ×100）Fig 1 Comparison of ROS in HepG2cells with DCFH-DA fluorescence staining（ ×100）

圖2 H-E染色觀察小鼠肝臟組織的變化（ ×200）Fig 2 Comparison of hepatic histopathology in mice with H-E staining（ ×200）

表3 苦菊提取物對(duì)急性肝損傷小鼠血清中ALT和AST的影響Tab 3 Effect of Cichoriumendivia L.extract on serum ALT and AST in acute liver injury mice

2.3 苦菊提取物對(duì)Ames菌回復(fù)突變的影響 在加與不加S9活化系統(tǒng)的條件下，苦菊提取物各劑量組回變菌落數(shù)均未超過溶劑對(duì)照組兩倍以上，而直接誘變劑2.0μg／皿4-NQO（作用于 TA97、TA98菌株）、1.5μg／皿 NaN3（作用于 TA100，TA1535菌株）、1.0μg／皿 MMC（作用于TA102菌株），間接誘變劑60.0μg／皿 2-AF（作用于 TA97、TA98、TA100、TA102 菌株）、200.0μg／皿 CP（作用于TA1535菌株），在相同試驗(yàn)條件下，誘發(fā)五菌株產(chǎn)生的回復(fù)突變菌落數(shù)均超過溶劑對(duì)照兩倍以上，表明所用實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可靠。由此可見，在本試驗(yàn)條件下，苦菊提取物在0.5～5 000.0μg／皿濃度范圍內(nèi)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌株TA97，TA98，TA100，TA102，TA1535均無(wú)致基因突變作用（表4）。

表4 苦菊提取物的Ames試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Effect of Cichoriumendivia L.extract in Ames test

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)苦菊提取物進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)鑒定，初步發(fā)現(xiàn)了5個(gè)化合物，它們分別是2-糠醇-（5′→11）-1，3-環(huán)戊二烯并［5，4-c］-1H-噌啉、山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、腺苷和苯乙醇葡萄糖苷，其中2－糠醇-（5＇→11）-1，3-環(huán)戊二烯并［5，4-c］-1H-噌啉為新發(fā)現(xiàn)的化合物，山奈酚及其衍生物可能是苦菊提取物的主要抗氧化活性成分。以上結(jié)果為苦菊提取物的抗氧化作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)［3］。

AAPH可在37℃下降解產(chǎn)生ROO－自由基，ROO－自由基與氧迅速發(fā)生反應(yīng)，形成過氧化物自由基攻擊細(xì)胞，引起細(xì)胞的損傷［5］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，苦菊提取物對(duì)AAPH誘導(dǎo)的兔血紅細(xì)胞損傷有抑制作用，提示苦菊提取物具有抗氧化損傷的能力［2］。本結(jié)果顯示，苦菊提取物在一定濃度下可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的上升，有效保護(hù)HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。此外，不同提取方式的苦菊提取物對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞氧化損傷也具有保護(hù)作用［3，6］。這些結(jié)果皆提示苦菊提取物可能具有良好的護(hù)肝功效。

CCl4會(huì)引起人和動(dòng)物的肝臟損傷，導(dǎo)致急性中毒，其引起急性肝損傷的病理基礎(chǔ)是自由基產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化［7］。通過肝組織的病理學(xué)檢查，本研究發(fā)現(xiàn)CCl4能明顯導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞炎癥損傷嚴(yán)重，表明小鼠急性肝損傷造模成功。相比之下，苦菊提取物處理組小鼠的肝組織壞死和炎癥病變程度明顯減輕。ALT和AST是反映肝損傷最早和最敏感的指標(biāo)，當(dāng)肝細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，或者甚至肝細(xì)胞有實(shí)質(zhì)性損害時(shí)，肝臟中的ALT和AST大量釋放入血。有研究發(fā)現(xiàn)，只要肝臟中有1%的肝細(xì)胞壞死，就可使血清中轉(zhuǎn)氨酶含量增加1倍［8］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組小鼠血清AST和ALT水平顯著升高比較，苦菊提取物治療組小鼠血清AST和ALT水平明顯下降，并呈濃度依賴的趨勢(shì)，提示肝臟漿膜趨于穩(wěn)定和受損的肝組織正在修復(fù)，與病理組織檢查的結(jié)果相符。因此，苦菊提取物對(duì)CCl4引起的急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明，不同提取方式的苦菊提取物對(duì)t-BHP所致小鼠急性肝損傷也具有保護(hù)作用［3，6］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證苦菊提取物的護(hù)肝保肝效應(yīng)。

Ames試驗(yàn)是篩檢遺傳毒性致癌物最為廣泛和敏感的試驗(yàn)。該試驗(yàn)用的不同基因型的組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌在無(wú)外源性組氨酸供給的情況下不能生長(zhǎng)繁殖，但它們各自具有獨(dú)特的回復(fù)突變“靶點(diǎn)”順序，在不同類型的誘變劑誘發(fā)回復(fù)突變后，菌株可在無(wú)外源性組氨酸供給的情況下生長(zhǎng)繁殖［9］。本試驗(yàn)中用到的菌株TA97，TA98可檢測(cè)移碼突變，TA100和TA1535可檢測(cè)堿基對(duì)置換，TA102可檢測(cè)移碼突變及堿基置換，它們分別從不同角度判定受試樣品致基因突變性［10－11］。本試驗(yàn)以直接誘變劑MMC，4-NQO和NaN3作為陽(yáng)性對(duì)照品，觀察苦菊提取物對(duì)菌株的致突變作用，同時(shí)還通過S9活化苦菊提取物和間接誘變劑2-AF，CP來判定苦菊提取物代謝物的致突變性。以上實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，苦菊提取物及其經(jīng)S9活化后的代謝物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌株TA97，TA98，TA100，TA102和TA1535均無(wú)致基因突變作用。鑒于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究可以初步判斷苦菊提取物無(wú)致突變作用。

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（編輯：張慧茹）

Protection ofCichoriumendiviaL.Extract from Liver Injury and Its Mutagenesis

CHEN Chaojie1，SHI Rui2，ZHAN Lijuan3，WEI Jinfeng4，JIN Hongtao4，QIN Hailin5，WANG Aiping2
1.Fujian Center for Safety Evaluation of New Drug，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350108，China；
2.New Drug Safety Evaluation Center，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；
3.State Key Laboratory of Cardiovascular Disease，China Oxford Centre for International Health Research，F(xiàn)uwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100050，China；
4.Beijing Union-Genius Pharmaceutical Technology Ltd，Beijing 100050 China；
5.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences ＆Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

ObjectiveTo investigate the protective effect ofCichoriumendiviaL.extract（CEE）on injured liverinvitroandinvivo，and the mutagenesis of CEE.MethodsThe viability and levels of the reactive oxygen species（ROS）in HepG2cells exposed to 2，2’-Azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride（AAPH）was measured by MTT assay and DCFH-DA fluorescence dye assay，respectively.The carbon tetrachloride（CCl4）induced acute liver injury model in mice was used to evaluate the hepatic histopathological change and the levels of serum ALT and AST. The mutagenesis of CEE was assessed by Ames test.. ResultsTreatment of HepG2cells with AAPH reduced the cell viability and increased intracellular ROS levels，those effects could be reversed by addition of CEE. The hepatocyte necrosis and inflammatory change in acute liver injury mice induced by CCl4were improved by administration of CEE，the ALT and AST levels in the mice serum were reduced in a dose-dependent manner，indicating that CEE had the capacity of hepatoprotection. CEE did not show mutagenic effect as detected in Ames test.Conclusion CEE effectively protects the liver from the injury with little toxicity and no mutagenicity.

CichoriumendiviaL.；plant extracts；liver；acetates；cells，cultured；disease models，animal

R282.71；R285；R329.2；R575

A

1672-4194（2014）01-0007-07

2013-11-19

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題（2013ZX09302302），國(guó)家自然基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81302756），福建省自然科學(xué)基金青年科技人才創(chuàng)新項(xiàng)目（2013J05118），福建醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金（2011bs003）

1.福建醫(yī)科大學(xué) 福建省新藥安全性評(píng)價(jià)中心，福州350108；
2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院／北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，北京 100050；
3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院／北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國(guó)家心血管病中心，阜外心血管病醫(yī)院，中國(guó)牛津國(guó)際醫(yī)學(xué)研究中心心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100037；
4.北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，北京100176；
5.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院／北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050

陳超杰（1982－），男，助理研究員，藥學(xué)博士

王愛平.Email：wangaiping＠imm.ac.cn