作物遺傳育種研究進(jìn)展Ⅲ.作物基因工程與基因組編輯

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙410128）

作物遺傳育種研究進(jìn)展Ⅲ.作物基因工程與基因組編輯

劉忠松

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙410128）

從育種應(yīng)用角度對(duì)利用基因工程和基因組編輯技術(shù)拓寬作物遺傳變異的意義、特點(diǎn)、原理和基本方法進(jìn)行了評(píng)述，著重介紹了近10年來(lái)內(nèi)源轉(zhuǎn)基因和同源轉(zhuǎn)基因、新靶標(biāo)基因、多基因工程、葉綠體基因工程和基因組編輯技術(shù)的研究新進(jìn)展，同時(shí)比較了它們的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為合理選擇利用這些新技術(shù)創(chuàng)制新種質(zhì)提供基礎(chǔ)。

作物；遺傳育種；基因工程；基因組編輯

遺傳變異是育種選擇的基礎(chǔ)。遺傳變異的主要來(lái)源一是基因突變，二是基因重組，三是基因轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的基因工程使基因在不同物種間實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，是利用基因轉(zhuǎn)移擴(kuò)大作物遺傳變異的重要途徑，在作物育種上已經(jīng)廣泛利用，已培育出第一代、第二代轉(zhuǎn)基因作物［1，2］。近年來(lái)開(kāi)發(fā)的基因組編輯技術(shù)可使作物基因組進(jìn)行定點(diǎn)改造，通過(guò)斷裂的雙鏈DNA非同源末端結(jié)合或同源重組，導(dǎo)致基因突變、基因重組和基因轉(zhuǎn)移，將在定向改變作物的遺傳、拓寬作物遺傳變異來(lái)源中發(fā)揮重要作用。此外，轉(zhuǎn)基因和基因組編輯也是研究基因功能的重要方法。

1 作物基因工程

基因工程是指將不同DNA（或基因）在體外進(jìn)行酶切和連接，構(gòu)成重組DNA分子，然后借助生物方法或理化方法將外源基因?qū)氲街参锛?xì)胞，導(dǎo)入的目的基因整合到植物基因組進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)改變植物特定性狀的目的。

1.1 內(nèi)源轉(zhuǎn)基因和同源轉(zhuǎn)基因

由于遺傳密碼具有通用性，基因可在不同的生物之間進(jìn)行交流或轉(zhuǎn)譯，因而轉(zhuǎn)基因的目的基因可來(lái)源于植物、動(dòng)物和微生物甚或人工合成。第一代轉(zhuǎn)基因作物的目的基因抗除草劑、抗蟲(chóng)基因主要來(lái)自于細(xì)菌，這引發(fā)人們對(duì)轉(zhuǎn)基因安全性的擔(dān)憂。為了解決轉(zhuǎn)基因安全性問(wèn)題，Rommens［3］和Schouten等［4］提出了intragenesis（內(nèi)源轉(zhuǎn)基因）和cisgenesis（同源轉(zhuǎn)基因），即利用雜交親和的植物來(lái)源的基因作為轉(zhuǎn)基因的目的基因。在同源轉(zhuǎn)基因中包括啟動(dòng)子、終止子在內(nèi)的目的基因來(lái)自于同種作物或雜交親和植物，完整轉(zhuǎn)移，不對(duì)基因進(jìn)行改造操作，而在內(nèi)源轉(zhuǎn)基因中目的基因的各個(gè)部分可能來(lái)自于同種作物或雜交親和植物的不同基因，需將不同基因的各功能成分（編碼區(qū)、啟動(dòng)子、終止子）進(jìn)行重組（圖1）［5］。

圖1 同源轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源轉(zhuǎn)基因的比較

1.2 基因工程的新靶標(biāo)

基因多數(shù)編碼蛋白質(zhì)，如編碼酶的基因、編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，但也有不編碼蛋白質(zhì)、而編碼RNA的基因，如microRNA基因。第一代甚至第二代轉(zhuǎn)基因主要集中在編碼酶的基因，以期改善作物的投入性狀（如抗除草劑、抗蟲(chóng)）和產(chǎn)出性狀（如富營(yíng)養(yǎng)化等品質(zhì)性狀）。轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控遺傳網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)基因的表達(dá)，利用轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)⒏淖円粭l路徑上全部或多個(gè)基因的表達(dá)，因此可用于復(fù)雜性狀（如抗旱性）的改良。但利用轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因時(shí)，應(yīng)注意轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)具有時(shí)空特征，需要利用組織專一性或誘導(dǎo)性表達(dá)啟動(dòng)子［6］。小RNA是指長(zhǎng)度短于200個(gè)堿基的RNA，包括microRNA、小干擾RNA（siRNA）等，它們通過(guò)剪切基因轉(zhuǎn)錄本或抑制轉(zhuǎn)錄本翻譯而使基因沉默，從而調(diào)控基因的表達(dá)。通過(guò)增強(qiáng)或干擾小RNA基因的表達(dá)可以改變小RNA基因調(diào)控的靶標(biāo)基因控制的性狀的表達(dá)（圖2）［7～10］。

圖2 基于小RNA基因的轉(zhuǎn)基因策略

1.3 多基因基因工程和基因聚合

作物的許多性狀都是復(fù)雜的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制的，導(dǎo)致單個(gè)基因?qū)π誀畹母牧纪荒軠愋?，需要同時(shí)導(dǎo)入多個(gè)有利基因才能達(dá)到目的。多基因基因工程有多條途徑（圖3）［11］。一是基因聚合（圖3A），攜帶不同轉(zhuǎn)基因的植株通過(guò)傳統(tǒng)育種方法雜交、回交，將轉(zhuǎn)基因聚合到優(yōu)良品種中，這種轉(zhuǎn)基因聚合方法也叫做育種聚合（breeding stack）。育種聚合花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，能聚合的基因數(shù)目有限（4個(gè)以內(nèi)），而且在后代中會(huì)發(fā)生遺傳分離，難以保持。二是重復(fù)轉(zhuǎn)化（圖3B），轉(zhuǎn)基因植株作為受體材料用另一基因的表達(dá)載體再轉(zhuǎn)化。這種途徑需要多輪轉(zhuǎn)化，在每次轉(zhuǎn)化時(shí)需要用不同的選擇標(biāo)記基因或?qū)?biāo)記基因切除，基因分別整合和表達(dá)，在后代中分離，需要回交而且難以獲得所有轉(zhuǎn)基因的純合系。三是非連鎖基因共轉(zhuǎn)化（圖3C），將多個(gè)目的基因分別構(gòu)建載體，然后同時(shí)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍方法對(duì)受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，多個(gè)基因往往能隨機(jī)串聯(lián)整合到受體的同一位點(diǎn)，但對(duì)多個(gè)基因（3個(gè)基因）不適用。四是連鎖基因轉(zhuǎn)化（圖3D），有時(shí)也叫分子聚合（molecular stack），是將多個(gè)目的基因轉(zhuǎn)化到同一表達(dá)載體，用一個(gè)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因整合到基因組的一個(gè)位點(diǎn)。由于轉(zhuǎn)基因緊密連鎖，后代轉(zhuǎn)基因基本不會(huì)發(fā)生分離。這種途徑存在的問(wèn)題是多個(gè)基因（如8～10個(gè)基因）在進(jìn)行克隆、組裝時(shí)可能需要用不同的啟動(dòng)子［13］，需要有合適的限制酶切位點(diǎn)和載體構(gòu)建平臺(tái)［14］。由于合成生物學(xué)的興起，合成DNA或基因方便而高效，這一問(wèn)題已迎刃而解。另一問(wèn)題是需要用高容量轉(zhuǎn)化載體如BIBAC、TAC等，即使這樣，轉(zhuǎn)化上限也在200 kb以下（一般80～150 kb），而且載體不穩(wěn)定，容易片段化，位于載體3′端的基因往往表達(dá)低。為了克服這一問(wèn)題，并將更多基因同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，正在致力于人工染色體或合成染色體研究。人工染色體長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)Mb，能攜帶數(shù)十甚至數(shù)百個(gè)基因，且目標(biāo)基因的導(dǎo)入不會(huì)破壞內(nèi)源基因的表達(dá)，因此是多基因轉(zhuǎn)移有希望的載體［15］。

圖3 多基因基因工程途徑

1.4 葉綠體基因工程

植物細(xì)胞除了有細(xì)胞核基因組外，細(xì)胞質(zhì)的葉綠體和線粒體也有自己的基因組。盡管線粒體基因工程停滯不前，但葉綠體基因工程已取得突破，近20種雙子葉植物都能通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化獲得質(zhì)體轉(zhuǎn)基因植株［16］。

與細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因相比，質(zhì)體轉(zhuǎn)基因具有4大優(yōu)勢(shì)：（1）大多數(shù)植物的質(zhì)體為細(xì)胞質(zhì)遺傳，轉(zhuǎn)基因不會(huì)通過(guò)花粉擴(kuò)散；（2）一個(gè)細(xì)胞中有上百個(gè)質(zhì)體，每個(gè)質(zhì)體中有上百個(gè)基因組，同質(zhì)的轉(zhuǎn)基因質(zhì)體的拷貝數(shù)多，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因高水平表達(dá)；（3）質(zhì)體基因不會(huì)發(fā)生基因沉默，轉(zhuǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定；（4）質(zhì)體基因組為原核基因組，基因以操縱子形式排列，適宜多基因轉(zhuǎn)化。

與核轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)整合不同，葉綠體轉(zhuǎn)基因通過(guò)同源重組定點(diǎn)整合到葉綠體基因組（圖4B），因此利用葉綠體基因序列作為同源重組序列（圖4A）來(lái)構(gòu)建表達(dá)框。葉綠體基因組具有原核生物的特點(diǎn)，基因以多順?lè)醋舆M(jìn)行表達(dá)，且采用基因槍進(jìn)行葉綠體基因轉(zhuǎn)化，能導(dǎo)入50 kb大小DNA到葉綠體，因此適合多基因的轉(zhuǎn)化（圖3E），在光合作用、品質(zhì)代謝、抗性改良和重組蛋白生產(chǎn)均有重要作用。葉綠體轉(zhuǎn)基因雖然不能通過(guò)花粉有性轉(zhuǎn)移，但可以通過(guò)無(wú)性嫁接實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移［17］，利用嫁接融合體細(xì)胞再生將葉綠體轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到其他植物。

葉綠體轉(zhuǎn)基因目前在單子葉植物上尚未取得成功，需要利用綠色葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過(guò)程繁瑣，組織培養(yǎng)必不可少，轉(zhuǎn)基因只在綠色組織高表達(dá)，而在非綠色組織是低表達(dá)，因此需要研究如何提高非綠色組織葉綠體轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，利用非綠色組織高表達(dá)基因（如accD基因）的啟動(dòng)子和5′端調(diào)控元件可能是途徑之一。

2 作物基因組編輯

基因工程是將單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)結(jié)構(gòu)和功能已知的目的基因插入到作物的基因組，而基因組編輯是將DNA雙鏈定點(diǎn)切開(kāi)，使雙鏈斷裂，DNA雙鏈斷裂后，能夠激活細(xì)胞內(nèi)固有的非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）機(jī)制，將斷裂的DNA修復(fù)，DNA修復(fù)過(guò)程可導(dǎo)致基因插入、基因點(diǎn)突變、染色體結(jié)構(gòu)變異（圖5）［18］。

2.1 基因組編輯的主要特點(diǎn)

基因組編輯是利用蛋白或RNA對(duì)基因組的特定序列具有專一識(shí)別的特性設(shè)計(jì)、構(gòu)建人工內(nèi)切核酸酶，從而使DNA雙鏈在特定位置斷裂，因此這種斷裂是位點(diǎn)特異的，可以對(duì)基因進(jìn)行定向突變。

決定基因組編輯的靶標(biāo)位點(diǎn)短（表1），只要有作物的基因組序列或基因序列，就可以利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行靶標(biāo)位點(diǎn)預(yù)測(cè)，基因組中任意符合條件的位點(diǎn)均可進(jìn)行編輯，基因組編輯頻率高。

基因組編輯既可以通過(guò)病毒載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，又可以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行。由于基因組編輯是使靶標(biāo)基因突變，而核酸酶轉(zhuǎn)基因可以通過(guò)雜交分離去除，基因組編輯的結(jié)果是非轉(zhuǎn)基因植株（圖6）［19］。

2.2 基因組編輯技術(shù)

從2005年基因組編輯技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，已開(kāi)發(fā)的基因組編輯技術(shù)有鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)／Cas9蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR／Cas9）三種技術(shù)（圖7）［18，20，21］。

ZFN是人工將具有獨(dú)特的DNA序列識(shí)別的鋅指蛋白（zinc finger，ZF）與非特異性核酸內(nèi)切酶（nuclease）FokⅠ連接合成的酶，其中鋅指蛋白負(fù)責(zé)DNA特異序列的識(shí)別，每個(gè)鋅指蛋白都能夠識(shí)別一個(gè)特定的三聯(lián)體堿基，在鋅指蛋白的指導(dǎo)下FokⅠ二聚體在特定的位置將DNA雙鏈切開(kāi)。

TALEN是用類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)物（TALE）代替了鋅指蛋白作為DNA結(jié)合域與FokⅠ切割結(jié)構(gòu)連接形成的核酸酶。通過(guò)TALE（由33～35個(gè)氨基酸的重復(fù)序列構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)因子蛋白）第12位和第13位氨基酸（這兩個(gè)氨基酸被稱為RVDs）識(shí)別特異的DNA序列，F(xiàn)okⅠ酶二聚化產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性，從而在特定位點(diǎn)將DNA序列精確切開(kāi)。目前已發(fā)現(xiàn)了5種RVDs，分別與特異的堿基對(duì)應(yīng)：組氨酸-天冬氨酸（HD）特異識(shí)別堿基C、天冬酰胺-異亮氨酸（NI）識(shí)別堿基A、天冬酰胺-天冬酰胺（NN）識(shí)別堿基G或A、天冬酰胺-甘氨酸（NG）識(shí)別堿基T、天冬酰胺-絲氨酸（NK）可以識(shí)別A、T、C、G中的任一種。由于TALEN的RVD對(duì)于核苷酸的識(shí)別是一一對(duì)應(yīng)的，為識(shí)別某一特定氨基酸序列，只需要設(shè)計(jì)相應(yīng)TALE單元串聯(lián)克隆即可，所以TALEN的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和篩選比ZFN簡(jiǎn)單得多，具備比ZFN更廣闊的應(yīng)用潛力。

CRISPR／Cas9基因組編輯技術(shù)不同于ZFN和TALEN基因組編輯技術(shù)，它不是以蛋白質(zhì)識(shí)別DNA序列，而是以一條短的向?qū)NA識(shí)別特異結(jié)合的DNA序列，通過(guò)CRISPR位點(diǎn)附近的雙鏈DNA核酸內(nèi)切酶Cas9在向?qū)NA引導(dǎo)下對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割。Cas9與FokⅠ酶的功能類似，但是它并不需要形成二聚體就能發(fā)揮作用。CRISPR／Cas9基因組編輯技術(shù)只需要設(shè)計(jì)短的向?qū)NA序列，設(shè)計(jì)、組裝都很方便，因此快速得到了應(yīng)用，在基因組編輯技術(shù)中似有后來(lái)居上之勢(shì)［22，23］。

上述3種基因組編輯技術(shù)在原理、修飾效率、構(gòu)建方法、操作難度以及應(yīng)用成本等方面具有較大差異（表1）。

表1 基因組編輯技術(shù)比較［18，20，21］

2.3 基因組編輯技術(shù)改良植物基因組的步驟

（1）分析和確定待改良性狀及其目標(biāo)基因；（2）針對(duì)目標(biāo)基因DNA序列構(gòu)建1對(duì)（或多對(duì)）內(nèi)切核酸酶表達(dá)基因盒，并將其裝載入合適的植物表達(dá)載體；（3）利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等遺傳轉(zhuǎn)化途徑，將工程核酸酶基因表達(dá)盒導(dǎo)入目標(biāo)植物細(xì)胞；（4）分化獲得轉(zhuǎn)工程核酸酶基因植株；（5）對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行剪切位點(diǎn)的DNA序列分析及目標(biāo)基因的表達(dá)分析；（6）對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型檢測(cè)，包括目標(biāo)基因性狀和其它主要農(nóng)藝性狀；（7）轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)自交或與其它材料雜交，篩選剔除轉(zhuǎn)入的外源DNA片段、同時(shí)目標(biāo)基因又得到了修飾的轉(zhuǎn)基因植株；（8）與常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合，培育剔除不利性狀基因或激活目標(biāo)基因的植物新品種。在這些環(huán)節(jié)中，也可以在分化獲得轉(zhuǎn)基因植株前，在細(xì)胞水平檢測(cè)不同工程核酸酶的定點(diǎn)剪切效果，并確定是否對(duì)工程核酸酶基因表達(dá)盒進(jìn)行優(yōu)化。

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2014 04 21

劉忠松（1963-），男，湖南常寧人，博士，教授，從事作物遺傳育種研究與教學(xué)。