綿羊、山羊內(nèi)源肺腺瘤病毒啟動(dòng)子甲基化修飾檢測(cè)

高宇君，趙 敏，周艷喜，馬學(xué)恩

（1．山西省太谷縣畜牧獸醫(yī)中心，太谷 030800；2．山西省晉中石羊飼料有限公司；3．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院）

疾病防控

綿羊、山羊內(nèi)源肺腺瘤病毒啟動(dòng)子甲基化修飾檢測(cè)

高宇君1，趙 敏2，周艷喜2，馬學(xué)恩3

（1．山西省太谷縣畜牧獸醫(yī)中心，太谷 030800；2．山西省晉中石羊飼料有限公司；3．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院）

為分析綿羊和山羊內(nèi)源性肺腺瘤病毒啟動(dòng)子甲基化修飾狀況，參照綿羊、山羊內(nèi)源性肺腺病毒gag基因上游非編碼區(qū)序列CpG島設(shè)計(jì)特異性甲基化引物，采用甲基化特異性PCR（MSP）方法檢測(cè)了5只綿羊和5只山羊胎兒的肺臟、皮膚、血液基因組內(nèi)源性病毒基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況。結(jié)果表明：山羊和綿羊肺臟、皮膚、血液基因組中均存在甲基化和非甲基化的內(nèi)源性肺腺瘤病毒啟動(dòng)子。

綿羊；山羊；啟動(dòng)子；甲基化；檢測(cè)

DNA甲基化是遺傳學(xué)修飾的一種重要形式，其主要特點(diǎn)是基因組可以通過對(duì)CpG序列的胞嘧啶進(jìn)行甲基化修飾［1-2］，在DNA本身序列并不改變的條件下調(diào)控基因的表達(dá)?；蚣谆揎椪{(diào)節(jié)蛋白表達(dá)是目前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。檢測(cè)基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)可為從DNA水平上研究基因表達(dá)奠定基礎(chǔ)［3-5］。基因中CpG豐富的區(qū)域被稱為CpG島，多種基因的啟動(dòng)子、基因復(fù)制的起始區(qū)和基因第一外顯子都包含多個(gè)CpG島。

根據(jù)目前的研究，動(dòng)物基因組DNA中約有60%以上基因的啟動(dòng)子包含CpG島［6］，并且CpG中有70%～80%胞嘧啶被甲基化修飾。脊椎動(dòng)物基因組內(nèi)的CpG含

量大約為42%。但甲基化胞嘧啶可以自發(fā)脫氨基而形成胸腺嘧啶，因此實(shí)際的CpG含量比預(yù)測(cè)分析的量少。內(nèi)源肺腺瘤病毒（enJSRV）存在于綿羊、山羊等基因組內(nèi)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性病毒啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子前的非編碼區(qū)內(nèi)存在CpG島。本研究用重亞硫酸鹽對(duì)基因組DNA處理，并檢測(cè)CpG島在綿羊、山羊基因組內(nèi)的存在情況，旨在對(duì)enJSRV甲基化和表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 材料

1.1 動(dòng)物

5只2 ～4月齡綿羊胎兒購(gòu)于呼和浩特市某羊場(chǎng)，5只山羊組織樣本購(gòu)于呼和浩特市某屠宰場(chǎng)。采取綿羊和山羊的肺臟、皮膚、血液樣本作為檢測(cè)素材。

1.2 試劑

LA Taq DNA聚合酶、GC Buffer、dNTP、IPTG、X-gal、DNA Marker DL 15 000、pMD18-T等為寶生物工程有限公司產(chǎn)品，Tissue/Blood DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒為天根公司產(chǎn)品，EpiTect Bisulfite Kit為凱杰生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

包括電子天平（來多利斯科學(xué)儀器），PCR儀（Biometra），震蕩儀（Thermo），迷你離心機(jī)（其林貝爾），凝膠成像系統(tǒng)（Sagecreation），電泳儀（Bio-Rad），離心機(jī)（Thermo），電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Tek），超純水儀（Elga），恒溫?fù)u床（Tensus），制冰機(jī)（Graxt），微量移液器（Eppendor），-80℃超低溫箱（Haier），超凈工作臺(tái)（Boxun），微波爐（格蘭仕），等等。

2 方法

2.1 CpG島擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)

利用亞硫酸氫鈉對(duì)基因組DNA處理后，DNA堿基發(fā)生改變，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，DNA中甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶。利用在線Methprmer軟件設(shè)計(jì)引物，分別用來擴(kuò)增綿羊、山羊內(nèi)源性肺腺瘤病毒基因啟動(dòng)子處于甲基化狀態(tài)和非甲基化狀態(tài)的等位基因（見表1）。引物由Invitrogen公司合成。

表1 CpG島擴(kuò)增引物

2.2 基因組DNA提取和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

在托盤上提取綿羊胎兒的肺臟、皮膚、血液組織。用液氮處理綿羊、山羊肺臟組織并研磨成粉末狀，根據(jù)天根公司Tissue/Blood DNA提取試劑盒操作步驟提取綿羊和山羊基因組DNA，用0.5%的瓊脂糖檢測(cè)提取DNA，再將提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度純度。最后根據(jù)凱杰生物技術(shù)有限公司的EpiTect Bisulfite Kit試劑盒操作步驟，用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化各樣品基因組DNA。將純化的DNA溶液放-20℃冰箱保存。

2.3 綿羊、山羊enJSRV啟動(dòng)子區(qū)甲基化和非甲基化區(qū)擴(kuò)增

以亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA為模板，以O(shè)MSPF/MSPR、OUSPF/OUSPR、GMSPF/GSPR、GUSPF/GUSPR為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：25 μL，LATaq DNA聚合酶0.25 μL，dNTP 4 μL，LA buffer 2.5 μL，滅菌水15.25 μL，上、下游引物各1 μL，模板基因組DNA1 μL。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火30 s（4對(duì)引物退火溫度依次為60℃、58℃、55℃、56℃），72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。72℃最后延伸5 min，4℃保存。進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

2.4 擴(kuò)增基因序列測(cè)定

按照凝膠回收試劑盒操作步驟純化PCR產(chǎn)物，將DNA洗脫于去離子水中。將純化的PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體，反應(yīng)體系：PCR回收產(chǎn)物 4.5 μL；pMD18-T載體0.5 μL，SolutionⅠ5 μL。16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，涂Amp/IPTG/X-Gal固體LB平板37℃培養(yǎng)過夜，挑取白色菌落在LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，作菌液PCR確定陽(yáng)性克隆送北京三博公司測(cè)序。

2.5 基因序列分析

應(yīng)用DNAStar、ClustalW2等生物軟件對(duì)測(cè)得擴(kuò)增片段進(jìn)行分析，并對(duì)基因組轉(zhuǎn)化序列一致性也進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR擴(kuò)增目的片段

以亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA為模板，以O(shè)MSPF/OMSPR、OUSPF/OUSPR、GMSPF/GMSPR、GUSPF/GUSPR為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增的目的片段大小分別為121、118、107和107bp，與理論擴(kuò)增的目的片段大小一致（見圖1）。

3.2 擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果

MSP轉(zhuǎn)化序列一致性是指基因組DNA經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理之后，擴(kuò)增得到的目的序列與原始基因組的一致性。4類擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)化序列一致性很好，都在97%以上。綿羊肺腺瘤病毒啟動(dòng)子甲基化MSP轉(zhuǎn)化序列一致性在98%以上。見表2。

圖1 綿羊、山羊內(nèi)源性病毒甲基化和非甲基化啟動(dòng)子擴(kuò)增結(jié)果

表2 MSP轉(zhuǎn)化序列一致性

3.3 組織中病毒啟動(dòng)子甲基化和非甲基化檢測(cè)

以O(shè)MSPF/OMSPR、OUSPF/OUSPR、GMSPF/GMSPR、GUSPF/GUSPR為引物，以處理的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳顯示，在綿羊所有組織中均檢測(cè)出甲基化和非甲基化的病毒啟動(dòng)子。提取山羊組織DNA并檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在山羊所有組織中均檢測(cè)出甲基化和非甲基化的病毒啟動(dòng)子。

3.4 CPG島檢測(cè)

應(yīng)用Methprmer對(duì)綿羊、山羊內(nèi)源性肺腺瘤病毒啟動(dòng)子進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：綿羊內(nèi)源性肺腺瘤病毒啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到的CpG島大小為351 bp，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的目的片段包含13個(gè)CpG位點(diǎn)；山羊內(nèi)源性肺腺瘤病毒啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到的CpG島大小為271 bp，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的目的片段包含13個(gè)CpG位點(diǎn)。見圖2。

圖2 綿羊、山羊內(nèi)源性病毒啟動(dòng)子區(qū)CpG島

4 結(jié)論

綿羊、山羊組織基因組中均存在甲基化和非甲基化的內(nèi)源性肺腺瘤病毒啟動(dòng)子，而綿羊和山羊的內(nèi)源性肺腺瘤病毒啟動(dòng)子上都存在CpG島。DNA甲基化是遺傳學(xué)修飾的一種重要形式，在DNA本身序列并不改變的條件下調(diào)控基因的表達(dá)。徐萌杰等研究顯示，在綿羊、山羊不同組織中都有內(nèi)源性病毒表達(dá)，但表達(dá)量有所區(qū)別。由此推測(cè)，內(nèi)源性綿羊和山羊的肺腺瘤病毒的表達(dá)可能與病毒啟動(dòng)子甲基化修飾存在一定相關(guān)性，但其關(guān)系需要深入研究。

［1］Amaravadi L，MJ Klemsz.DNA methylation and chromatin structure regulate PU.1 expression［J］.DNACell Biol，1999，18（12）：875-884.

［2］Lu Q.DNA methylation and chromatin structure regulate T cell perforin gene expression［J］.Immunol，2003，170（10）：5124-5132.

［3］Miller C A，S L Campbell，J D Sweatt.DNA methylation and histone acetylation work in concert to regulate memory formation and synaptic plasticit［J］.Neurobiol Learn Mem，2008，89（4）：599-603.

［4］Tai K Y.DNA methylation and histone modification regulate silencing of epithelial cell adhesion molecule for tumor invasion and progression［J］. Oncogene，2007，26（27）：3989-3897.

［5］Lu T Y.DNA methylation and histone modification regulate silencing of OPGduringtumorprogression［J］.CellBiochem，2009，108（1）：315-325.

［6］Li W.DNAmethylation and histone modifications regulate shoot regeneration in Arabidopsis by modulating WUSCHEL expression and auxin signaling［J］.PLoSGenet，2011，7（8）：e1002243.

Detection of DNA Methylation of JSRV Promoter in Sheep and Goat

GaoYu-jun，ZhaoMin，Zhou Yan-xi，et al
（Taigu Center for Animal Husbandryand Veterinary,Taigu 030800，Shanxi，China）

In order to investigate the DNA methylation of JSRV promoter in sheep and goat，the primers were designed according tothe sequence ofCpGisland ofgene gag’s upstreamregulation sequence.Genomic DNAin lung，skin and blood of5 sheep and 5 goats were extraced，and the DNAmethylation was detected byusingtechnique ofMSP.The results showed that both non methylation promoter and methylation promoter were found in lung，skin and blood in sheep and goats genomic DNA.

sheep；goat；promoter；methylation；detection

S826．2

A

2095-3887（2014）03-0045-03

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．015

2014-03-19

高宇君（1968-），女，畜牧師。