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    吐魯番黑羊MSTN/Smad信號通路基因表達(dá)的發(fā)育性變化

    2014-03-02 01:39:39安外爾熱合曼吐來力江哈木太馬曉燕依明蘇來曼決肯阿尼瓦什新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院烏魯木齊830052
    中國草食動物科學(xué) 2014年3期
    關(guān)鍵詞:黑羊吐魯番月齡

    安外爾·熱合曼,吐來力江·哈木太,馬曉燕,依明·蘇來曼,決肯·阿尼瓦什(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

    吐魯番黑羊MSTN/Smad信號通路基因表達(dá)的發(fā)育性變化

    安外爾·熱合曼,吐來力江·哈木太,馬曉燕,依明·蘇來曼,決肯·阿尼瓦什(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

    為探討MSTN/Smad信號通路基因?qū)ν卖敺谘蚣∪馍L發(fā)育的影響,采用實時定量PCR法,分別對1~6月齡吐魯番黑羊的腿肌和尾脂MSTN/Smad信號通路基因進(jìn)行檢測。結(jié)果表明:MSTN/Smad信號通路基因在腿肌和尾脂組織中均有表達(dá),MSTN/Smad信號通路基因在吐魯番黑羊不同生長階段的腿肌和尾脂中的表達(dá)沒有出現(xiàn)隨月齡的增加而一直增加或下降的趨勢。

    吐魯番黑羊;MSTN/Smad信號通路基因;基因表達(dá);實時熒光定量PCR

    吐魯番黑羊主要生長在新疆吐魯番地區(qū)的托克遜縣,故又叫“托克遜黑羊”。吐魯番黑羊頭中等大,耳大下垂。公羊鼻梁隆起,具有較大的螺旋形角。母羊鼻梁稍有隆起,無角。頸中等長,額部有長毛,臉部有短毛。吐魯番黑羊適應(yīng)夏季40℃以上高溫天氣和冬季嚴(yán)寒、多風(fēng)沙的吐魯番盆地氣候,能耐受粗纖維多、木質(zhì)化強(qiáng)、多刺的耐鹽堿、抗旱的牧草植物。吐魯番黑羊在嚴(yán)酷的自然氣候條件和粗放的飼管條件下,均能表現(xiàn)出生長發(fā)育快、四肢粗壯、早熟、肉味鮮美等特點,是當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民重要的生產(chǎn)和生活資料,在當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)中占有相當(dāng)重要的地位。

    肌肉是動物胴體最重要的組成部分,是畜牧生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一。因此,增加肌肉產(chǎn)量和提高肌肉品質(zhì)一直是畜牧學(xué)家的主要研究目標(biāo)之一。1997年英國霍普金斯大學(xué)Mcpherron等利用簡并引物在小鼠身上偶然發(fā)現(xiàn)了肌肉生長抑制素(myostain,MSTN)基因。經(jīng)蛋白質(zhì)同源分析和核酸序列比對,證實其屬于TGF-β超家族成員,故又稱GDF-8[1]。MSTN基因編碼一個25 kD的

    二聚體的糖蛋白[2]。該糖蛋白在骨骼肌中廣泛表達(dá),其功能和表達(dá)量的變化可能會通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)而改變肌肉的纖維組成及造成肌肉重量的變化[3-4]。TGF-β家族成員主要是通過與細(xì)胞膜受體結(jié)合,將信號傳遞到下游分子Smad,磷酸化的Smda分子入核,調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[5]。

    關(guān)于新疆地方綿羊品種mRNA水平基因表達(dá)的研究較少,已有的研究主要集中在對肌內(nèi)脂肪相關(guān)基因的熒光定量方面。目前關(guān)于吐魯番黑羊肉質(zhì)性狀形成的分子生物學(xué)基礎(chǔ),尤其是基因表達(dá)方面的研究還未見報道。因此,本文以吐魯番黑羊為研究對象,利用相對定量RT-PCR技術(shù),對1~6月齡吐魯番黑羊的腿肌和尾脂組織中MSTN/Smad信號通路基因mRNA水平的發(fā)育性變化進(jìn)行系統(tǒng)研究和比較分析,旨在為該羊的分子生物學(xué)研究及其開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動物 試驗羊均購自托克遜縣地方國營牧場。選擇飼養(yǎng)條件相同、生長發(fā)育良好、體重相近的1、2、3、4、5、6月齡吐魯番黑羊各5只。屠宰后,取腿肌和尾脂等組織樣品,凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 主要儀器設(shè)備 TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)為美國Thermo公司產(chǎn)品;SW-CJ-IF型超凈工作臺購自上海博訊公司;LightCycler2.0熒光定量PCR儀為Roche公司生產(chǎn)。

    1.1.3 試劑盒及普通試劑 Trizol RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I熒光染料試劑盒、Taq酶、dNTP、DL2000、Marker等均購自TaKaRa公司,瓊脂糖(AgroseH)、無水乙醇、DEPC等試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。

    1.2 方法

    1.2.1 吐魯番黑羊組織總RNA提取及cDNA合成 取液氮保存的各樣本組織約100 mg。用Trizol法提取總RNA。分別吸取2 μL總RNA溶液,采用分光光度計測定濃度;采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總RNA質(zhì)量。檢測完成后將總RNA溶液迅速置于超低溫冰箱中(-80℃)保存。

    1.2.2 引物設(shè)計及合成 參照GenBank公布的綿羊基因序列,采用Primer 5.0軟件分別對MSTN、Smad2、Smad3、Smad4、TGFBR1、TGFBR2設(shè)計一對引物,由生工生物(上海)有限公司合成。6個基因的引物序列見表l。

    1.2.3 cDNA的合成 提取的總RNA按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。后-20℃保存。

    表1 目的基因及內(nèi)參基因引物序列

    1.2.4 目的基因的定量 將合成的cDNA產(chǎn)物按熒光定量的要求做濃度稀釋,使用ABI79(X)型熒光定量PCR儀對各組織中的MSTN/Smad信號通路基因和β-actin基因進(jìn)行定量分析。具體反應(yīng)體系:RNase Free ddH2O 9.4 μL,10 μmol/L上、下引物各1.0 μL。2×SYBR Premix EX Taq 10 μL,cDNA模板2.0 μL。MSTN反應(yīng)條件:95℃10 s(預(yù)變性);95℃5 s,60℃30 s,40個循環(huán);95℃10 s;65~95℃升溫0.5℃/s(Plate Read)。以β-actin為對照,對MSTN/Smad基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行校正。

    1.2.5 統(tǒng)計分析 Roche公司Light Cycler 2.0熒光定量PCR儀所得的循環(huán)閾值(Ct)數(shù)據(jù)應(yīng)用Delta-Delta Ct方法進(jìn)行相對定量分析,內(nèi)參及目的基因的相對表達(dá)水平應(yīng)用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。每個分析對象均取3次重復(fù)試驗數(shù)據(jù)的平均值,每次試驗用ddH2O為陰性對照。利用2-ΔΔCt方法計算表達(dá)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RNA純度和完整性分析

    提取的總RNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后可見較

    清晰的28S、18S和5SRNA帶。其中5S帶較淺,表明RNA無明顯降解(圖1)。經(jīng)分光光度計檢測,A260/A280比值在1.8~2.0,表明RNA的純度高,適宜進(jìn)行定量分析。

    圖1 總RNA2%凝膠瓊脂糖鑒定結(jié)果

    2.2 MSTN/Smad信號通路基因mRNA相對表達(dá)量比較

    從表2可見,1~6月齡吐魯番黑羊的腿肌和尾脂在不同生長階段之間MSTN/Smad表達(dá)存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異,每個月齡肌肉中的表達(dá)量明顯高于對應(yīng)月齡尾脂的表達(dá)量。MSTN基因在4月齡肌肉中的表達(dá)量最高;Smad4在5月齡肌肉中表達(dá)量最高,在6月齡尾脂中的表達(dá)量最低;Smad3的表達(dá)量無論是在腿肌還是尾脂中均比Smad2低。TGFBR2在1月齡腿肌中的表達(dá)量最高,在2月齡尾脂中的表達(dá)量最低。表明生長階段對于MSTN/Smad信號通路基因在綿羊腿肌和尾脂組織中的表達(dá)具有重要影響。

    表2 MSTN/Smad信號通路基因在吐魯番黑羊不同月齡和組織中的表達(dá)

    3 討論

    自從發(fā)現(xiàn)MSTN與肌肉生長發(fā)育特別是雙肌臀形成有關(guān)后,關(guān)于MSTN的作用機(jī)制便成為研究的熱點問題[6]。越來越多的研究結(jié)果顯示,MSTN可能通過 TGFBR/Smad通路發(fā)揮作用。具體作用途徑:MSTN首先在成肌細(xì)胞中合成前體蛋白,前體蛋白經(jīng)過一次酶切后去除24個氨基酸的信號肽部分,接著在RSRR位點經(jīng)過第2次酶切,產(chǎn)生了N-端和C-端片段[5]。C-端被切割后,片段之間通過二硫鍵相連形成二聚體,折疊成胱氨酸的結(jié)構(gòu)[7]。研究發(fā)現(xiàn),將不同濃度的外源性表達(dá)的MSTN蛋白質(zhì)加入到C2C12成肌細(xì)胞的培養(yǎng)物中,隨著MSTN濃度的增加,成肌細(xì)胞的繁殖速度相應(yīng)減慢[8-9]。這表明,MSTN表達(dá)量的升高會造成肌肉生長速度的下降。在本研究中MSTN基因在4月齡吐魯番黑羊腿肌中表達(dá)量最高,在6月齡尾脂中的表達(dá)量最低。Smad2基因在腿肌與尾脂中的表達(dá)量明顯高于Smad3相應(yīng)月齡的表達(dá)量。TGFBR2基因的表達(dá)量高于TGFBR1的表達(dá)量。結(jié)果表明:MSTN/Smad信號通路基因在吐魯番黑羊中沒有出現(xiàn)隨月齡增加而一直升高或降低的趨勢。

    [1]Lee SJ,Mcpherron AC.Myostatin and the control of skeletal muscle mass[J].Curropin Genet Dev,1999(9):604-607.

    [2]Zúniga J E,Groppe J C,Cui Y,et al.Assembly of TbetaRI:TbetaRII:TGFbeta ternary complex in vitro with receptor extracellular domains is cooperative and isoform-dependent[J].J Mol Biol,Epub 2005,354(5):1052-1068.

    [3]DooleyS,Hamzavi J,BreitkopfK,et al.Smad7 prevents activation ofhepatic stellate cells and liver fibrosis in rats[J].Gastro-enterology,2003,125:178-191.

    [4]Guo X,Wang X F.Signaling cross-talk between TGF-β/BMP and other pathways[J].Cell Res,2009,19(1):71-88.

    [5]Kambadur R,Sharma M,Smith T P L,et a1.Mutations in myostatin(GDF8)in double-muscled belgain blue and piedmontese cattle[J]. Cold SpringHarbor LaboratoryPress,1997(7):910-915.

    [6]甘尚權(quán),劉守仁,王新華,等.MSTN基因在動物科學(xué)和醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展[J].草食家畜,2006(6):131-132.

    [7]張增榮,朱慶.肌肉生長抑制素(MSTN)基因的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2007(1):19-21.

    [8]孟詳人,馬月輝,葉紹輝.肌肉生長抑制素基因的研究進(jìn)展[J].家畜生態(tài)學(xué)報,2007(7):28,4.

    [9]張利媛,岳文斌.MSTN基因的研究進(jìn)展[J].草食家畜,2006(3):1-4.

    Developmental Changes of Expression of MSTN/Smad Signaling Pathway Genes in Turpan Black Sheep

    Anwaier·Rehemam,Tulailijiang·Hamutai,Jueken·Aniwash,et al
    (College ofAnimal Science,XinjiangAgricultural University,Urumqi 830052,China)

    In order to explore the developmental changes of expression of MSTN/Smad signaling pathway genes on the muscle growth and development in Turpan black sheep duringthe age of1~6 months,the expression level of MSTN/Smad signaling pathway genes in the leg muscle and tail fat tissues were detected with Real time quantitative PCR.The results showed that the MSTN/Smad signaling pathway genes were expressed both in the leg muscle and tail fat tissues,but no continuous change trends were found.

    Turpan black sheep;MSTN/Smad signalingpathwaygene;gene expression;Real-time PCR

    S826.2

    A

    2095-3887(2014)03-0012-03

    10.3969/j.issn.2095-3887.2014.03.003

    2014-02-17

    國家自然科學(xué)基金項目(31260530)

    安外爾·熱合曼(1986-),男,維吾爾族,碩士研究生。

    決肯·阿尼瓦什(1962-),男,哈薩克族,教授,博士。研究方向:動物遺傳育種與繁殖。

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