五味子果汁對四氯化碳致大鼠急性肝損傷的保護作用

劉長姣，于徊萍，孟憲梅，張守勤

（1.吉林工商學(xué)院，糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林長春130062；2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130022）

五味子果汁對四氯化碳致大鼠急性肝損傷的保護作用

劉長姣1，2，于徊萍1，孟憲梅1，張守勤2，*

（1.吉林工商學(xué)院，糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林長春130062；2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長春130022）

應(yīng)用四氯化碳（CCl4）致大鼠急性肝損傷模型研究五味子果汁的護肝作用。實驗各組大鼠灌胃相應(yīng)實驗樣品，用生物化學(xué)法檢測大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（AKP）活性，肝勻漿中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性及丙二醛（MDA）的含量，并觀察肝組織光鏡下病理變化。結(jié)果表明五味子果汁可以顯著降低CCl4致急性肝損傷大鼠血清中AST和AKP的活性，增強大鼠肝組織勻漿中GHS-Px、SOD和CAT活力，顯著降低MDA含量，與模型組相比各果汁組肝臟病理變化顯著改善。證明五味子果汁對CCl4致大鼠急性肝損傷具有保護作用，為五味子果汁在保健食品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

五味子，護肝作用，果汁，四氯化碳

肝臟疾病是一種發(fā)病率高、難以根治的疾病，對人類健康危害極大。我國各種肝病的發(fā)病率非常高，例如，病毒性肝炎特別是乙型肝炎的發(fā)病率占世界首位；隨著物質(zhì)生活水平的提高及酒精消耗量增多，脂肪肝及酒精肝也明顯增多。近年的研究表明，中藥有較好改善乙肝病人的臨床癥狀、保肝降酶退黃及一定程度的抗乙肝病毒（11BV）的作用，而且副作用少[1]。五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Bail）是常用護肝中藥之一，含有酚類成分和木脂素等多種功能性成分。已有研究證明五味子具有降低肝組織脂質(zhì)過氧化，提高氧自由基清除能力，對肝損傷具有一定的保護作用，并具有降低酒精性肝損傷的作用[2-6]。

五味子是可用于保健食品的中藥[7]，目前其應(yīng)用主要以干燥果實的形式入藥，在保健食品中的應(yīng)用較少。五味子漿果呈紅色、果汁味道偏酸，并具有五味子獨特的風(fēng)味。五味子木脂素成分主要存在于種子中，因此可以將果汁與種子分別加以開發(fā)利用，種子可入藥，果汁可開發(fā)保健食品，如保健飲料。到目前為止對五味子果汁護肝活性的研究尚未見報道，本文應(yīng)用CCl4致大鼠肝損傷模型來測定五味子果汁的護肝活性，為五味子漿果果汁在保健食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，以促進五味子漿果的深加工和開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

五味子漿果 采于吉林省撫松縣；實驗用雄性W istar大鼠 由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供；四氯化碳（CCl4） 武漢巿江北化學(xué)試劑廠；ALT試劑盒、AST試劑盒、AKP試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒、CAT試劑盒、GSH-Px試劑盒 均購于南京建成生物工程研究所。

UV-2550型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DZKW-C型恒溫水浴禍、TGL-16B型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-3200DE型數(shù)據(jù)超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器 上海安亭電子儀器廠；RJ-TDL-40B型離心機 無錫瑞江；MA 110型電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；倒置顯微鏡 日本OLYMPUS；推拉式切片機 德國Leica。

1.2 實驗樣品制備

取五味子鮮果，經(jīng)自制機械破碎（避免破碎種子）后，4000r/m in離心10m in，得上清液，為五味子果汁樣品。五味子果汁樣品配制：依據(jù)五味子果汁固形物含量（0.91g/m L），取五味子果汁適量，蒸餾水稀釋，配制得到護肝實驗高劑量實驗樣品，濃度為50mg/m L；并依次用蒸餾水稀釋得到中劑量和低劑量實驗樣品，濃度分別為25mg/m L和12.5mg/m L。

1.3 護肝活性實驗設(shè)計分組及給藥

健康雄性W istar大鼠60只，體重180～220g。大鼠在實驗室適應(yīng)3d后，只隨機分為6組，每組10只，分別為空白對照組、果汁高劑量組（500mg/kg·bw）、果汁中劑量組（250mg/kg·bw）、果汁低劑量組（125mg/kg·bw）、模型組、陽性對照組（益肝靈，500mg/kg·bw），分別灌胃給藥。果汁高、中、低劑量均按1.0m L/100g給藥。

1.4 造模及取材

各組實驗大鼠，按實驗設(shè)計灌胃給藥，連續(xù)7d，末次給藥1h后，除空白對照組外其余各組均腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液1m L/kg·bw[8]，空白對照組腹腔注射等體積橄欖油，禁食不禁水，室溫為22℃，24h后，稱量體重。眼球取血，-20℃冰箱中保存；大鼠頸椎脫臼處死，快速取出肝臟；距肝大葉邊緣0.5cm處取一小塊肝組織，將其放于10%甲醛溶液中固定，留做HE染色；剩余肝組織放于-80℃冰箱中保存。另取0.5g肝組織，用生理鹽水清洗，用PBS做成10%肝組織勻漿，測MDA、SOD等指標。

1.5 血清生化指標檢測

按試劑盒說明書測定血清ALT、AST和AKP活性，并按試劑盒方法計算。

1.6 肝組織勻漿的制備與生化指標檢測

1.6.1 肝組織勻漿的制備 肝臟以0.9%NaCl溶液沖洗，用濾紙吸干后，準確稱量1.00g。用預(yù)冷的0.9% NaCl，組織勻漿機制成勻漿，3500r/min離心20min，上清即為肝組織勻漿。

1.6.2 生化指標檢測 取10%肝組織漿，按試劑盒方法測肝組織中SOD、GSH-Px和CAT活性，MDA的含量，并按試劑盒方法計算。

1.7 病理組織學(xué)觀察及結(jié)果判斷

將放在10%甲醛溶液中固定的肝組織取出，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，HE染色，用40倍光學(xué)顯微鏡觀察組織病理變化。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（x±S）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，用方差分析進行樣本均數(shù)間兩兩比較，兩組間比較無顯著性以（p＞0.05）表示，差異有顯著性以（p＜0.05）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子果汁對大鼠血清中ALT、AST和AKP活性的影響

五味子果汁對大鼠血清中ALT、AST和AKP活性的影響結(jié)果見表1。模型組血清中的ALT和AST活力與空白對照組相比明顯上升，說明CCl4致大鼠肝臟受到嚴重損傷，造模成功。五味子果汁3個劑量組的ALT活性與對照組比較，具有顯著性差異（p＜0.05）；與模型組比較，無顯著性差異（p＞0.05）；與陽性對照組比較，無顯著性差異（p＞0.05）；組間比較呈劑量依賴性降低。由此可知，五味子果汁不能顯著地降低血清中ALT活力，但與陽性對照藥物組之間無顯著性差異，說明果汁也具有一定的降低血清中ALT活性的能力。五味子果汁3個劑量組的AST活性與模型組比較，均具有顯著性差異（p＜0.05）；與陽性對照組比較，無顯著性差異（p＞0.05）；組間比較呈劑量依賴性降低，證明五味子果汁能顯著地降低CCl4致急性肝損傷大鼠血清中AST的活性。五味子果汁3個劑量組的AKP活性與空白對照組和陽性對照組比較，均無顯著性差異（p＞0.05）；與模型組比較，均具有顯著性差異（p＜0.05）；組間比較呈劑量依賴性降低。表明五味子果汁能顯著降低CCl4致急性肝損傷大鼠血清中AKP活性。

由此可知五味子果汁可顯著降低CCl4致急性肝損傷大鼠血清中AST和AKP的活性。隨五味子果汁劑量的增加，血清中ALT、AST和AKP的活性下降，并低于模型組，證明五味子果汁對CCl4致急性肝損傷大鼠的肝細胞膜有一定的修復(fù)或保護肝細胞膜受損作用，從而起到保護肝臟的作用。

表1 五味子果汁對大鼠血清ALT、AST和AKP活性的影響（±s，n=10）Table 1 Effectof S.chinensis juice on the activities of ALT，AST and AKP in rat plasma（±s，n=10）

表1 五味子果汁對大鼠血清ALT、AST和AKP活性的影響（±s，n=10）Table 1 Effectof S.chinensis juice on the activities of ALT，AST and AKP in rat plasma（±s，n=10）

注：a：p<0.05，vs空白對照組；b：p<0.05，vs模型組；c：p<0.05，vs陽性對照組；表2同。

AKP（金氏單位/100mL）空白對照 36.75±7.82 77.35±14.24 59.42±5.90損傷模型 200.38±30.90 174.10±16.69 79.47±10.64低劑量 194.80±15.97a 113.65±8.72ab 67.15±8.16b中劑量 180.22±18.21a107.15±10.54ab 60.02±8.89b高劑量 177.58±21.91a 101.80±9.09ab 57.99±7.77b陽性對照 187.41±14.20 107.65±13.81 62.62±14.70組別 ALT（卡門式單位）AST（賴式法單位）

表2 五味子果汁對大鼠肝組織不同酶活性和MDA的影響（±s，n=10）Table 2 Effectof S.chinensis juice on the activities of three different enzymes and MDA in rat live（r±s，n=10）

表2 五味子果汁對大鼠肝組織不同酶活性和MDA的影響（±s，n=10）Table 2 Effectof S.chinensis juice on the activities of three different enzymes and MDA in rat live（r±s，n=10）

組別 GSH-Px（U） SOD（U/mg prot） CAT（U/mg prot） MDA（nmol/mg prot）空白對照 18.65±1.89 74.53±2.50 89.72±2.78 14.80±1.77損傷模型 14.20±1.89 57.70±1.27 68.32±7.67 24.80±1.51低劑量 15.80±2.15abc 64.66±2.87ab 79.09±6.21ab 22.15±1.71abc中劑量 17.37±1.36b 70.02±2.40ab 79.33±4.15ab 20.38±1.72abc高劑量 17.85±0.68b 73.03±2.58b 86.85±5.49bc 17.40±2.42ab陽性對照 17.29±1.15 68.83±4.12 80.00±3.27 17.74±2.98

2.2 五味子果汁對大鼠肝組織中GSH-Px、SOD和CAT活性的影響

五味子果汁對大鼠肝組織中GSH-Px、SOD和CAT三種酶活性影響的結(jié)果見表2。結(jié)果表明五味子果汁中劑量組和高劑量組的GSH-Px活性與空白對照組比較，無顯著性差異（p＞0.05）。3個劑量組與模型組比較，均具有顯著性差異（p＜0.05）。組間比較呈劑量依賴性增高。表明五味子果汁中劑量組和高劑量組可以顯著提高損傷肝臟中GSH-Px的活性。隨著五味子果汁劑量增加，損傷肝臟中GSH-Px的活性增高，可降低細胞內(nèi)有害的過氧化物代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，從而起到保護損傷肝細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。

五味子果汁高劑量組SOD活性與空白對照組比較，無顯著性差異（p＞0.05）。3個劑量組與模型組比較，均具有顯著性差異（p＜0.05）。3個劑量組與陽性對照組比較，均無顯著性差異（p＞0.05）。組間比較呈劑量依賴性增高。表明五味子果汁能顯著提高損傷肝臟中SOD活性，并且隨著劑量增加，損傷肝臟中SOD的活性增高，能夠更好地防止體內(nèi)自由基引起的膜脂質(zhì)過氧化，進而起到保護肝臟傷的作用。

五味子果汁高劑量組CAT的活性與空白對照組比較，無顯著性差異（p＞0.05）；3個劑量組與模型組比較，均具有顯著性差異（p＜0.05）；低劑量組和中劑量組與陽性對照組比較，無顯著性差異（p＞0.05）；高劑量組與陽性對照組比較有顯著性差異（p＜0.05）。組間比較呈劑量依賴性增高趨勢。表明五味子果汁可以有效提高損傷肝臟中CAT活性，隨著五味子果汁劑量增加，損傷肝臟中CAT的活性增高，提高機體清除OH·自由基的能力，從而起到一定的保護肝臟的作用。

綜上可知，五味子果汁對CCl4致急性肝損傷大鼠，具有提高肝組織中GSH-Px、SOD和CAT活性的作用，從而起到保護CCl4致急性肝損傷大鼠的作用。

2.3 五味子果汁對大鼠肝組織中MDA的影響

五味子果汁對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織中MDA含量影響的測定結(jié)果見表2。五味子果汁3個劑量組的MDA含量與空白對照組和模型組比較，均具有顯著性差異（p＜0.05）；高劑量組與陽性對照組比較，無顯著性差異（p＞0.05）；組間比較呈劑量依賴性降低。表明五味子果汁可以顯著降低損傷肝臟中MDA的含量。五味子果汁隨著劑量增加，損傷肝臟中MDA含量降低，可知五味子果汁具有一定的抑制脂質(zhì)過氧化的作用，減輕組織細胞損傷，從而起到一定的保護肝損傷的作用[9]。

2.4 肝臟組織病理學(xué)研究

光鏡所見對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常、清晰，細胞排列整齊，大小均勻，細胞核位于細胞中央，圓而邊界清；模型組大鼠肝細胞明顯水腫、氣球樣變，肝索排列紊亂，可見肝細胞索解離，肝小葉內(nèi)點狀壞死，中央靜脈和匯管區(qū)出現(xiàn)彌漫性的炎細胞浸潤；而各給藥組大部分肝細胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，肝細胞水腫、氣球樣變及炎細胞浸潤均明顯減輕，與模型組相比各給藥組肝臟病理變化顯著改善，見圖1。

圖1 五味子果汁對損傷肝組織病理形態(tài)的影響（HE染色）Fig.1 The influence of differentextracts of S.chinensis on the pathology of the injury liver（HE staining）

3 結(jié)論

應(yīng)用CCl4致大鼠急性肝損傷模型研究五味子漿果果汁的護肝作用。研究證明五味子果汁可顯著降低CCl4致急性肝損傷大鼠血清中AST和AKP的活性，隨五味子果汁劑量的增加，血清中ALT、AST和AKP的活性下降。造膜各組大鼠肝組織中MDA含量較正常對照組及各給藥組明顯升高，GHS-Px、SOD和CAT活性明顯下降，而給以五味子果汁實驗組大鼠肝組織勻漿中MDA含量明顯下降，GHS-Px、SOD和CAT活力增強。結(jié)果證明五味子果汁對CCl4致大鼠急性肝損傷具有保護作用，為五味子果汁在保健食品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Hepatoprotective effects of Schisandra chinesis（Turcz.）Bail juice on carbon tetrachloride induced acute liver damage in rats

LIU Chang-jiao1，2，YU Huai-ping1，M ENG Xian-mei1，ZHANG Shou-qin2，*
（1.Jilin ProvinceKey LaboratoryofGrainand OilProcessing，Jilin Businessand TechnologyCollege，Changchun130062，China；2.Biological and Agricultural College，Jilin University，Changchun 130022，China）

The p rotective effects of Schisand ra chinensis（Turcz.）Bail juice against liver damage in carbon tetrachloride（CCl4）-induced acute hepatotoxicity in rats were studied.Wista rats were orally fed w ith detected samp les.The activities of ALT，AST and AKP in serum and GSH-Px，SOD and CAT in live were detected.The contentof MDA in liverwas also tested.The liver tissue pathological change was observed.The results showed that S.chinensis juice could significantly decrease the activities of AST and AKP in serum and significantly increase the ac tivities of GSH-Px，SOD and CAT in liver.The content of MDA in liver was also significantly decreased.Com pared w ith the model g roup the pathological change in liver of each S.chinensis juice g roup was significantly im p roved.The results p roved that S.chinensis fruit juice had a p rotective effect on CCl4-induced acute liver damage in rats.This p rovided the basis for S.chinensis juice app lication in health food.

Schisand ra chinensis（Turcz.）Bail；liver p rotection；juice；carbon tetrachloride

TS201.4

A

1002-0306（2014）18-0355-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.071

2013－12－27 *通訊聯(lián)系人

劉長姣（1981-），女，博士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物有效成分提取與分離。

國家自然科學(xué)基金資助項目（30472135）。