一株木質(zhì)纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育及產(chǎn)酶條件研究

陳英連，付 正，張良雨，管 斌，孔 青

（1.中國海洋大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）2.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東濟(jì)南250002）

一株木質(zhì)纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育及產(chǎn)酶條件研究

陳英連，付 正，張良雨，管 斌*，孔 青

（1.中國海洋大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）2.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東濟(jì)南250002）

主要通過紫外（UV）和甲基磺酸乙酯（EMS）的交替誘變的方法提高綠色木霉的產(chǎn)酶能力，并成功篩選到了一株產(chǎn)酶活性較高的菌株，其在平板篩選培養(yǎng)基中的透明圈直徑與菌落直徑之比達(dá)到2.1，傳代穩(wěn)定后在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中纖維素酶活（CMCase）和濾紙酶活（FDAase）分別達(dá)到21.05U/mL和2.4U/mL。之后經(jīng)培養(yǎng)基的優(yōu)化進(jìn)一步提高其酶活，最終誘變菌株在最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基中CMCase達(dá)到22.5U/mL，F(xiàn)DAase達(dá)到2.52U/mL。

綠色木霉，誘變，纖維素酶，液體發(fā)酵

纖維素類物質(zhì)廣泛存在于自然界中，最為常見的為農(nóng)作物秸稈。這類物質(zhì)一般未經(jīng)處理就被丟棄或者直接將其燃燒，對環(huán)境產(chǎn)生了很大污染。而如果通過生物方法將其轉(zhuǎn)化，得到可以直接被人類或牲畜利用的可再生的生物資源，這不僅可以解決環(huán)境污染問題，還能在一定程度上緩解生物資源的短缺[1]。

木質(zhì)纖維素類物質(zhì)其主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，這三種成分隨植物物種不同含量也有所不同，其中纖維素和半纖維素含量占大部分[1-2]。目前對木質(zhì)纖維原料的利用主要集中在纖維素和半纖維素的利用，所以原料的預(yù)處理即為將木質(zhì)素分離，得到纖維素半纖維素的混合物，再利用纖維素酶將其分解為還原糖，從而進(jìn)一步發(fā)酵成所需的產(chǎn)物，如酸、酒精、單細(xì)胞蛋白等[3]。纖維素酶在生產(chǎn)還原糖這一重要步驟中起到了決定性作用，所以得到高產(chǎn)量的纖維素酶對整個轉(zhuǎn)化過程起到了關(guān)鍵性的作用。纖維素酶來源廣泛，很多植物和微生物都可以生產(chǎn)纖維素酶，而通過微生物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶由于其成本低、提取過程簡便、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)多年來吸引了大批的國內(nèi)外研究者。

很多微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶來分解纖維素成還原糖，研究較多的是絲狀真菌中的木霉屬、曲霉屬、根霉屬和漆斑霉屬，其中木霉屬被廣泛應(yīng)用，潛力較大的為綠色木霉[4-5]。有研究者利用綠色木霉與其他微生物共同培養(yǎng)，分解大米秸稈為還原糖[3，6]。一般直接從自然界分離的原始菌株其酶產(chǎn)量低，需利用生物學(xué)方法提高其酶活，包括理化誘變育種、基因工程育種等。其中誘變育種由于其操作簡單、速度快及收效顯著等特點(diǎn)被廣泛利用[7]。Kridztina kovacsa利用物理化學(xué)共同誘變的方法顯著提高了原始菌株的纖維素酶產(chǎn)量，并利用預(yù)處理的柳木生產(chǎn)得到了還原糖[8]。本文以綠色木霉為出發(fā)菌株，通過物理化學(xué)復(fù)合誘變得到了一株木質(zhì)纖維素酶高產(chǎn)菌株，傳代后穩(wěn)定性良好，進(jìn)一步通過對其培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，得到產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)基。為木質(zhì)纖維素酶的深入研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色木霉（Trichoderma viride 8140） 由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院酶工程研究室保藏，該菌株于PDA斜面培養(yǎng)基[5]上在4℃下保存；平板篩選培養(yǎng)基[9]Mandel’s營養(yǎng)鹽[10]1L，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5g，Triton X-100 1m L，瓊脂15g，pH 5.5；剛果紅溶液 剛果紅染料1g，蒸餾水1L；NaCl溶液1mol/L；液體發(fā)酵培養(yǎng)基[7]Mandel’s營養(yǎng)鹽1L，微晶纖維素10g，吐溫-80 2m L，pH 5.5；液體限量培養(yǎng)基：葡萄糖2g，（NH4）SO41g，KH2PO42g，H2O 1000m L，pH 6.0。

SPS202F型電子天平 梅特勒-托利多稱重設(shè)備有限公司：ZDX-35B1型高壓消毒鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；XK 24-1060007型電熱恒溫培養(yǎng)箱、SHZ-C型全溫空氣恒溫振蕩器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；PHS-2F型pH計、722N型可見分光光度計 上海精科電子有限公司；BCM-1000型超凈工作臺 江蘇凈集團(tuán)安泰公司；電子萬用爐 天津市泰斯特儀器有限公司；LD5-10B型低速離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；UV-2802PC型紫外分光光度計 尤尼克儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)方法 保藏的綠色木霉菌種接種于PDA斜面進(jìn)行活化，待形成一層綠色孢子，接種環(huán)平板劃線，剛果紅染色，三角瓶搖瓶復(fù)篩后得到酶活較高的一株菌作為出發(fā)菌株[11]。用無菌水沖洗斜面孢子，按103個/m L接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為50m L/300m L，于28℃、180r/m in培養(yǎng)8～10d，測定菌體生物量及酶活。

1.2.2 粗酶液提取 取培養(yǎng)6d的發(fā)酵液，置于離心管中4000r/min離心10min，取上清液為粗酶液，適當(dāng)稀釋后測定酶活。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取8支25m L比色管，分別加入2m L葡萄糖溶液，使葡萄糖含量分別為0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg，并分別加入2m L DNS，沸水浴5m in，定容至刻度，540nm處測定吸光值，制作吸光值與葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

1.2.4 菌種誘變[12]

1.2.4.1 采用紫外誘變與硫酸二乙酯物理化學(xué)復(fù)合誘變 分別進(jìn)行了兩輪處理，PDA斜面培養(yǎng)7d的菌株，生理鹽水沖洗，脫脂棉過濾，得到孢子懸液，接入液體限量培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)8～10h，3000r/m in離心10min去除培養(yǎng)液，生理鹽水洗滌2～3次，脫脂棉過濾除去菌絲體，血球板計數(shù)法計數(shù)[11]，調(diào)整孢子濃度為108個/m L。采用物理化學(xué)復(fù)合誘變，其木質(zhì)纖維素酶高產(chǎn)菌株的育種方案如圖1所示。

1.2.4.2 菌種初篩 將誘變后的菌液適當(dāng)稀釋后涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)3～4d，剛果紅染色并用NaCl溶液洗滌，對比透明圈的大小。選擇透明圈直徑/菌落直徑（Hc）≥1.5的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

圖1 纖維素酶高產(chǎn)菌株的育種過程Fig.1 The developmentof high cellulase producingmutants with UV-lightand EMS treatment

1.2.4.3 菌種復(fù)篩[12]初篩后的菌株，接種于液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7d，取培養(yǎng)液抽濾，得到濾液，5000r/m in，離心10m in，取上清液，適當(dāng)稀釋測定酶活。

1.2.5 誘變菌株部分培養(yǎng)基的優(yōu)化[9，14-15]對培養(yǎng)基的最佳碳源及其含量、最佳氮源、pH、金屬離子進(jìn)行了優(yōu)化。

1.2.5.1 碳源的優(yōu)化 培養(yǎng)基其他成分不變，將培養(yǎng)基的碳源分別設(shè)定為10g/L的微晶纖維素，10g微晶纖維素＋5g麩皮/L，10g微晶纖維素＋10g麩皮/L，10g微晶纖維素＋20g麩皮/L，5g微晶纖維素＋5g麩皮/L，5g微晶纖維素＋10g麩皮/L，5g微晶纖維素＋20g麩皮/L，20g麩皮/L。培養(yǎng)6d后測定酶活，確定最佳碳源。

1.2.5.2 氮源的優(yōu)化 碳源確定不變后，培養(yǎng)基其他成分不變，把培養(yǎng)基中的氮源分別用2g的無機(jī)氮源磷酸氫二銨、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和硝酸鈉代替。培養(yǎng)6d后測定酶活，確定最佳無機(jī)氮源。

1.2.5.3 金屬離子的優(yōu)化 分別研究了鎂離子和鈣離子對菌株產(chǎn)酶的影響，分別在培養(yǎng)基中添加0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的硫酸鎂，培養(yǎng)7d后測定酶活，確定硫酸鎂的添加量。分別在培養(yǎng)基中添加0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的無水氯化鈣，培養(yǎng)7d后測定酶活，確定氯化鈣的添加量。

1.2.5.4 pH的優(yōu)化 從相關(guān)文獻(xiàn)分析得知，綠色木霉的產(chǎn)酶最適pH范圍為4～7，所以設(shè)定pH梯度為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7。

1.3 測定方法

1.3.1 酶活測定方法

1.3.1.1 β-1.4-葡萄糖內(nèi)切酶活性（CMCase）的測定[13]向比色管中加入1.5m L的1%的醋酸纖維素鈉底物，50℃保溫，然后加入0.5m L適當(dāng)稀釋的粗酶液，50℃下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，2m LDNS終止反應(yīng)，沸水浴5min，定容至比色管刻度，混勻，540nm處測定吸光值。

1.3.1.2 濾紙酶活（FDA）的測定[13]向比色管中加入1.5m L pH為4.8的檸檬酸緩沖液和1cm×6cm大的濾紙條，50℃保溫，然后加入0.5m L適當(dāng)稀釋的粗酶液，50℃下準(zhǔn)確反應(yīng)60m in，2m L DNS終止反應(yīng)，沸水浴5min，定容至比色管刻度，混勻，540nm處測定吸光值。

式中：n為0.5m L酶液所生成的葡萄糖毫克數(shù)；0.5為所加酶液體積；30/60為反應(yīng)時間；0.18為mg和μmol的換算；所得酶活乘以稀釋倍數(shù)即為每毫升培養(yǎng)液的酶活。

1.3.2 菌體生物量的測定 以菌體干重（Dry Cell Weight）指示菌體生物量，取3m L適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液，加3m L 1mol/L HClO4，沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)20m in，取出后冷卻至室溫，冷凍離心機(jī)6000r/min離心10min，于紫外分光光度計260nm波長下測OD值，定為A。以離心去除菌體的澄清發(fā)酵液經(jīng)上述實驗作為對照調(diào)零，則每升發(fā)酵液菌體干重DCW=0.65×A×n[1]

式中，n：為發(fā)酵液稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，如圖2所示。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.5659x-0.013，R2=0.9981。

圖2 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.2 平板初篩的結(jié)果

出發(fā)菌株通過多次復(fù)合誘變，每次誘變通過初篩和復(fù)篩兩部。初篩根據(jù)在篩選平面皿（培養(yǎng)基）上形成的透明圈的大小，復(fù)篩根據(jù)三角瓶搖瓶（液態(tài)）培養(yǎng)的酶活，每次誘變后等酶活穩(wěn)定再進(jìn)行下步誘變。最終得到菌株T.viride8140UEUE4-80，如圖3所示。其透明圈直徑/菌落直徑=2.1。

圖3 誘變菌株在剛果紅培養(yǎng)基上透明圈展示Fig.3 Hydrolyzed zone on the selective plate

2.3 搖瓶復(fù)篩的結(jié)果

將原始菌株與誘變菌株在相同條件下同時液態(tài)培養(yǎng)，每天測定CMCase和FDA酶活。其搖瓶復(fù)篩結(jié)果如圖4～圖6所示。

圖4 原始菌株與誘變菌株CMCase對比Fig.4 Comparison of enzyme production curve betweenmutant strain and original strain

圖5 原始菌株與誘變菌株FDAase對比Fig.5 Comparison of enzyme production curve betweenmutant strain and original strain

圖6 原始菌株與誘變菌株菌體干重（DCW）的對比Fig.6 Comparison of DCW curve betweenmutant strain and original strain

從圖4～圖6可看出，在液態(tài)搖瓶培養(yǎng)條件下，原始菌株與菌株T.viride8140UEUE4-80 CMCase和FDAase的酶活力對比，菌株的生長無明顯變化，只是纖維素酶活力得到了較大幅度的提高。這一研究結(jié)果說明：誘變并沒有改變其生長量，而是改變了該株微生物分泌酶的產(chǎn)量?？赡苁钦T變處理改變了產(chǎn)酶相關(guān)基因，從而改變了其酶產(chǎn)量或者其酶活力。誘變株的CMCase比原始菌株提高了2倍，其FDAase力比原始菌株提高了1.5倍。誘變株的最高CMCase和FDAase酶活出現(xiàn)在液態(tài)培養(yǎng)的第7d，分別為22.79IU/m L和2.56IU/m L。廈門大學(xué)Xinde Jiang等[16]利用EMS和UV同時對綠色木霉出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，得到了一株突變株EU2-77，其CMCase達(dá)到了16.46IU/m L，F(xiàn)DAase達(dá)到了2.19IU/m L，分別比原始菌株提高了1.16倍和1.49倍。與之比較，本文所用EMS和UV的交替誘變方法較為有效，誘變效果比較明顯。

2.4 誘變菌株穩(wěn)定性研究

誘變菌株連續(xù)在PDA培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，每傳一代都接種于液態(tài)搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，測定酶活。其實驗結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖7 突變菌株傳代中CMCase（IU/mL）Fig.7 Effectof passage numbers on enzyme activity

圖8 突變菌株傳代中FDA（IU/mL）Fig.8 Effectof passage numbers on enzyme activity

由圖7、圖8可看出，誘變菌株傳到第六代時，其菌株酶活力無明顯下降，CMCase僅下降了0.92IU/m L，F(xiàn)DAase僅下降了0.09IU/m L，說明誘變基因穩(wěn)定性良好，并沒有產(chǎn)生回復(fù)突變，傳代中其突變的基因在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中保持較高的穩(wěn)定性，突變基因可穩(wěn)定的傳給每個菌株后代，并作為一種穩(wěn)定的性狀進(jìn)行表達(dá)。其菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性良好，可以用來進(jìn)行后續(xù)研究。

2.5 菌株培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.5.1 培養(yǎng)基中碳源的影響 由圖9可看出，當(dāng)微晶纖維素與麩皮同時加入時，其CMCase和FDA酶活達(dá)到最高，為最佳碳源配比。微晶纖維素加入量減少，酶活力下降趨勢明顯，說明微晶纖維素在培養(yǎng)基中主要誘導(dǎo)兩種酶的產(chǎn)生，隨麩皮增加其酶活力只出現(xiàn)了稍微的增加，而只加微晶纖維素時比加入5g麩皮時的酶活要高，說明麩皮對酶的誘導(dǎo)作用小于微晶纖維素，可能是由于麩皮中營養(yǎng)成分比較高，含有部分淀粉及其他糖類、良好的氮源等，纖維類物質(zhì)較少，而促進(jìn)產(chǎn)酶的主要是纖維類物質(zhì)的誘導(dǎo)，所以麩皮對產(chǎn)酶的誘導(dǎo)作用很小。

圖9 碳源配比對產(chǎn)酶的影響Fig.9 The effectof the ratio of Avicel and bran on enzyme production

2.5.2 培養(yǎng)基中無機(jī)氮源的確定 由圖10可看出，硫酸銨為其最佳無機(jī)氮源，其CMCase和FDAase達(dá)到最高，為13.12U/m L和2.09U/m L。在只加無機(jī)氮源時其酶活明顯比之前降低，所以說明培養(yǎng)基中有機(jī)氮源也有重要作用[1，10]，加有機(jī)氮源尿素和蛋白胨，不僅可以提供營養(yǎng)物質(zhì)，而且它們的添加對培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的pH起到一定的調(diào)節(jié)作用，相關(guān)文獻(xiàn)報道[11]其最佳添加量為尿素0.3g/L、蛋白胨0.75g/L。

圖10 無機(jī)氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.10 The effectof inorganic nitrogen on enzyme production

2.5.3 金屬離子對產(chǎn)酶的影響 在Mandel’s營養(yǎng)鹽中鎂離子和鈣離子作為主要的金屬離子影響菌株產(chǎn)酶活性[7]，鎂離子和鈣離子主要是通過影響酶的構(gòu)象從而影響酶活性。由圖11和圖12可看出，當(dāng)鎂離子和鈣離子添加量為0.3g/L時，其酶活力最高，含量增加或者減少都影響產(chǎn)酶。通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基最終得到CMCase為22.5U/m L FDAase酶活為2.52U/m L。

2.5.4 培養(yǎng)基的pH對產(chǎn)酶的影響 由圖13可看出，當(dāng)液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH為6時，其產(chǎn)酶活力最高，為最適pH。這時CMCase達(dá)到了23.16U/m L，濾紙酶活達(dá)到2.38U/m L。由上圖可以看出上述兩種酶的最佳產(chǎn)酶pH相同，pH降低或升高都會影響菌株的產(chǎn)酶活力，并且pH升高對產(chǎn)酶的影響明顯比pH下降對產(chǎn)酶的影響大，隨pH升高其兩種酶活都出現(xiàn)了明顯下降，這可能和綠色木霉其最適產(chǎn)酶環(huán)境為偏酸性培養(yǎng)介質(zhì)有關(guān)。

圖11 Mg2+對產(chǎn)酶的影響Fig.11 The effectofMg2+on enzyme production

圖12 Ca2+對產(chǎn)酶的影響Fig.12 The effectof Ca2+on enzyme production

圖13 pH對產(chǎn)酶的影響Fig.13 The effectof pH on enzyme production

3 結(jié)論

3.1 采用纖維素酶分泌能力較強(qiáng)的野生型菌株、經(jīng)初步篩選得到生產(chǎn)性菌株（經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)反復(fù)訓(xùn)化的菌株）作為出發(fā)菌株。

3.2 菌種誘變選用對木霉誘變效果較好的硫酸二乙酯，紫外線作為誘變劑，以新鮮的孢子菌懸液為誘變介質(zhì)，采用低劑量、反復(fù)多次復(fù)合誘變處理方法，獲得了較高的正突變率。

3.3 經(jīng)反復(fù)多次復(fù)合誘變處理和高效的初篩和復(fù)篩——“富集培養(yǎng)”，篩選得到了高產(chǎn)纖維素酶變異菌株。在此基礎(chǔ)上，又經(jīng)反復(fù)多次純種分離和搖瓶比較，逐步篩選出了一株產(chǎn)酶穩(wěn)定性較好的菌種。

3.4 通過對該變異菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，獲得的最佳培養(yǎng)基配方。利用原始綠色木霉經(jīng)過誘變，穩(wěn)定性研究，以及培養(yǎng)基優(yōu)化，最終得到誘變菌株最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基，其在最佳培養(yǎng)基中CMCase達(dá)到22.5U/m L FDAase酶活達(dá)到2.52U/m L。

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The development of high cellulase production mutant from Trichoderma Viride and study on the condition of enzyme production

CHEN Ying-lian，F(xiàn)U Zheng，ZHANG Liang-yu，GUAN Bin*，KONG Qing
（1.Food Science And Engineering College，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Shandong Medical College，Jinan 250002，China）

The cellulase p roduc tion strain T.viride 8140 was treated with UV and EMS.The mutant strain T.viride8140UEUE4-80 was showed to have a higher cellulase activity than others and the Hc of the mutant reached 2.1.After several passages its CMCase and FDAase were stabilized at 21.05U/m L and 2.4U/m L.The conditions of fermentation were studied and the op timal culture med ium was decided.Under the op timal culture med ium，the CMCase and FPAase of the mutant separately reached 22.5，2.52U/m L.

T.viride；mutagenesis；cellulose；liquid fermentation

TS201.3

A

1002-0306（2014）18-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.032

2013－12－20 *通訊聯(lián)系人

陳英連（1989-），女，碩士研究生，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃（2013BAD10B02-06）；青島市公共領(lǐng)域科技支撐計劃項目（11-2-3-63-nsh）；啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實驗室開放課題（K2012002）。