響應(yīng)面法優(yōu)化山稔葉總黃酮提取工藝的研究

吳萍萍，賴曼萍，尹艷艷，黃儒強(qiáng)

（華南師范大學(xué)，廣東廣州510631）

響應(yīng)面法優(yōu)化山稔葉總黃酮提取工藝的研究

吳萍萍，賴曼萍，尹艷艷，黃儒強(qiáng)

（華南師范大學(xué)，廣東廣州510631）

在提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間4個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)回流法提取山稔葉總黃酮的最佳工藝進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，最優(yōu)提取條件為提取溫度73℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液固比19∶1（mL/g）、提取時(shí)間124min，總黃酮提取率為5.426%，與模型預(yù)測(cè)值基本相符。山稔葉總黃酮對(duì)DPPH自由基清除作用呈一定的量效關(guān)系，其半數(shù)抑制濃度為9.797μg/mL。

山稔葉，總黃酮，響應(yīng)面，二苯基苦味?；诫?/p>

山稔（Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk），為桃金娘科植物，主要分布在中國、日本、泰國等東南亞地區(qū)[1]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，山稔葉味甘、澀，性平，可用于治療痢疾、泄瀉、極性腸胃炎、外傷出血等[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明山稔葉提取物具有抗氧化、抑菌、消炎、保護(hù)胃腸消化系統(tǒng)、降血壓、促進(jìn)成骨細(xì)胞增長等功效[3-7]。已有研究表明山稔葉中含有黃酮類化合物[4，8]，而黃酮類化合物具有廣泛的生理和藥理功能，是目前國內(nèi)外重點(diǎn)研究和應(yīng)用的天然植物功能性成分，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。

黃酮類化合物的提取方法有很多，如水提法、有機(jī)溶劑提取法、超臨界CO2萃取法、微波法、超聲波法、高速逆流色譜法（HSCCC）等[9]。響應(yīng)曲面法（Response Surface Methodology，RSM），是一種囊括了眾多實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，它可以建立連續(xù)變量曲面模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，確定最佳水平范圍[10]。

目前，國內(nèi)外對(duì)山稔葉藥理活性方面的研究較多，但是有關(guān)山稔葉中總黃酮的提取鮮有報(bào)道，因此，本文對(duì)山稔葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究，采用乙醇回流法，用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行分析，并通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到其最佳提取工藝，同時(shí)研究了山稔葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力，以期為山稔葉黃酮資源的開發(fā)與綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山稔葉 于2012年10月8日采自廣東省河源市；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；二苯基苦味?；诫拢―PPH） Sigma公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、石油醚等 均為分析純。

DJ-10A型電動(dòng)植物粉碎機(jī) 上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所有限公司；SFG-02B.600型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；VIS-723N可見光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[11]精確稱取0.0100g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶解后定容至100mL，即得0.1000g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL于6支25mL比色管中，用75%乙醇定容至10mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.7mL，搖勻，靜置5min后，加入10%硝酸鋁0.7mL，搖勻，靜置5min，再加入1mol/L氫氧化鈉5mL，并用75%乙醇定容至25mL，搖勻，靜置10min后，以蘆丁空白為對(duì)照，在波長510nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值對(duì)蘆丁質(zhì)量濃度作圖，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。經(jīng)線性回歸得到方程：y=12.5x-0.001（y：吸光度，x：濃度，mg/mL），R2=0.9997。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.2 材料預(yù)處理 將采摘的山稔葉曬干后，粉碎（40目）。取山稔葉粉末于索氏提取器中，用石油醚作溶劑，回流提取5h，去除葉綠素等脂類物質(zhì)，將預(yù)處理后的山稔葉粉末50℃烘干，置于干燥器中保存。

1.2.3 山稔葉總黃酮的提取 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的山稔葉粉末1.00g，至于100mL圓底燒瓶中，加入提取劑進(jìn)行回流提取，冷卻，5000r/min離心10min，取上清液1mL，測(cè)定總黃酮含量。

1.2.4 山稔葉總黃酮含量的測(cè)定 準(zhǔn)確量取已制備好的山稔葉總黃酮提取液1mL，總黃酮的提取率計(jì)算公式如下：

式中，c為1mL提取液定容后的蘆丁含量，mg/mL；1為從提取液中吸取的體積，mL；25為1mL提取液定容后的體積，mL；V為提取總黃酮時(shí)用的乙醇體積，mL；1000為山稔葉粉質(zhì)量，mg。

1.2.5 乙醇回流提取法單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 提取溫度 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的山稔葉粉末1.00g，按液固比30∶1（mL/g）加入75%乙醇水溶液，分別在40、50、60、70、80、90℃條件下，回流提取60min。

1.2.5.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的山稔葉粉末1.00g，按液固比30∶1（mL/g）加入乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液，50℃回流提取60min。

1.2.5.3 液固比 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的山稔葉粉末1.00g，按液固比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）加入75%乙醇水溶液，50℃回流提取60min。

1.2.5.4 提取時(shí)間 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的山稔葉粉末1.00g，按液固比30∶1（mL/g）加入75%乙醇水溶液，50℃分別回流提取60、80、100、120、140、160min。

1.2.6 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間4個(gè)因素作為響應(yīng)變量，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立四因素三水平數(shù)學(xué)模型，以山稔葉總黃酮的提取率為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)表Table.1 Factors and levels of RSM

1.2.7 山稔葉總黃酮清除DPPH自由基活性測(cè)定 量取2.0mL不同濃度（0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30μg/mL）的總黃酮提取液，加入2.0mL 200μmol/L DPPH（乙醇），室溫放置30min后，測(cè)定反應(yīng)液在517nm處的吸光度，并通過下式計(jì)算DPPH清除率[12]。

清除率（%）=[（A0-A1）/A0]×100

式中：A0為DPPH的吸光度，A1為最終反應(yīng)液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇回流提取法單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)山稔葉總黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨著溫度的增加，總黃酮提取率先升后降，溫度在40～70℃，黃酮提取率急劇上升，70℃時(shí)達(dá)到最大值，溫度繼續(xù)增加時(shí)，黃酮提取率下降，并趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)樵谝欢囟确秶鷥?nèi)，隨著溫度的升高，分子解附和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)速度加快，從而有利于提高黃酮提取量。但是不能無限制的增大溫度，太高的溫度會(huì)對(duì)黃酮類化合物的穩(wěn)定性有影響。所以本實(shí)驗(yàn)選擇提取溫度為70℃。

圖2 提取溫度對(duì)山稔葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction efficiency of total flavonoids

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山稔葉總黃酮提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，總黃酮提取率最大。乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%時(shí)，提取率隨濃度的增加而下降。這是由于黃酮類化合物是一大類極性范圍很廣的物質(zhì)[13]，在50%乙醇溶液中，醇溶性和水溶性的總黃酮都能最大程度的溶出。而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過50%時(shí)，溶劑極性降低，從而減少了大極性黃酮類化合物的溶出，導(dǎo)致總黃酮的提取率下降。所以本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山稔葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of total flavonoids

2.1.3 液固比對(duì)山稔葉總黃酮提取率的影響 從圖4可知，當(dāng)液固比在5∶1～20∶1范圍內(nèi)時(shí)，黃酮提取率隨液固比的增大而上升，液固比為20∶1時(shí)，提取率最高。之后，黃酮提取率變化不大，這可能是由于物料與溶劑邊界層濃度差減小，擴(kuò)散達(dá)到平衡。所以從節(jié)約溶劑的角度考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇液固比為20∶1。

圖4 液固比對(duì)山稔葉總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on extraction efficiency of total flavonoids

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)山稔葉總黃酮提取率的影響 由圖5可知，隨著提取時(shí)間的延長，山稔葉總黃酮提取率不斷升高；但當(dāng)提取時(shí)間超過120min后提取率開始下降。這是因?yàn)閯傞_始時(shí)提取時(shí)間過短，總黃酮還未充分溶出；隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮溶出量逐漸增大，提取率逐漸升高；繼續(xù)延長提取時(shí)間，未溶出的總黃酮量很少，其他雜質(zhì)可能增多，導(dǎo)致提取率下降。故本實(shí)驗(yàn)選擇提取時(shí)間為120min。

2.2 山稔葉總黃酮提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 選用中心復(fù)合模型，做四因素三水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)（5個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

圖5 提取時(shí)間對(duì)山稔葉總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of time on extraction efficiency of total flavonoids

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table.2 Experiment design and result of RSM

經(jīng)回歸擬合后，得到以山稔葉總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值的回歸方程：Y=5.31+0.54A-0.035B-0.12C+ 0.20D+0.038AB+0.027AC-0.030AD-0.12BC-0.015BD+ 0.080CD-0.79A2-0.51B2-0.40C2-0.52D2。

用Design Expert 8.0.5b軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，其方差分析見表3。從表3可以看出，回歸方程失擬檢驗(yàn)p＞0.05，差異不顯著，說明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很??；回歸方程擬合檢驗(yàn)p＜0.0001，差異極顯著，說明模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值非常吻合，模型成立。同時(shí)回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9856，說明響應(yīng)值的變化有98.56%來源于所選變量，即乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間和提取溫度。因此，該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以用其確定最佳提取工藝條件。此外，各因素中一次項(xiàng)A、D及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)黃酮的提取影響極顯著（p＜0.001），C（液固比）對(duì)黃酮提取的影響高度顯著（p＜0.01）；交互項(xiàng)BC對(duì)黃酮的提取影響顯著（p＜0.05）；而B、AB、AC、AD、BD、CD的影響差異不顯著。

表3 回歸模型參數(shù)檢驗(yàn)Table.3 Parameter estimate of regression model

2.2.2 各因子交互作用對(duì)總黃酮得率影響的分析RSM方法的圖形是特定的響應(yīng)面（Y）與對(duì)應(yīng)的因素A、B、C、D構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖，每個(gè)響應(yīng)面對(duì)其中兩個(gè)因素進(jìn)行分析，另外兩個(gè)因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，從實(shí)驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析圖上可以找到它們?cè)谔崛∵^程中的相互作用。回歸優(yōu)化響應(yīng)面圖分別見圖6～圖11。

圖6 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的曲面圖Fig.6 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect of temperature and ethanol concentration on extraction efficiency of total flavonoids

圖7 提取溫度和液固比對(duì)總黃酮提取率的等高線圖和曲面圖Fig.7 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect of temperature and liquid-solid ratio on extraction efficiency of total flavonoids

圖6～圖11直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，由等高線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。比較六組圖可知：提取溫度（A）對(duì)桃金娘葉片總黃酮提取的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；而提取時(shí)間（D）、液固比（C）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

圖8 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的等高線圖和曲面圖Fig.8 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect of temperature and time on extraction efficiency of total flavonoids

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比對(duì)總黃酮提取率的等高線圖和曲面圖Fig.9 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect of ethanol concentration and liquid-solid ratio on extraction efficiency of total flavonoids

圖10 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的等高線圖和曲面圖Fig.10 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect of ethanol concentration and time on extraction efficiency of total flavonoids

2.2.3 最優(yōu)提取工藝及驗(yàn)證 通過Design Expert 8.0.5b軟件分析得到的山稔葉總黃酮最佳提取工藝為提取溫度73℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液固比19∶1（mL/g）、提取時(shí)間124min，黃酮提取率理論值為5.443%。在此條件下，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，山稔葉黃酮提取率為5.426%。與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為0.31%。而且重復(fù)性也很好，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

圖11 液固比和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的等高線圖和曲面圖Fig.11 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect of liquid-solid ratio and time on extraction efficiency of total flavonoids

2.3 山稔葉總黃酮對(duì)DPPH自由基清除作用

由圖12可以看出山稔葉總黃酮對(duì)DPPH自由基具有明顯的清除效果，且在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。當(dāng)樣品濃度為18μg/mL，清除率達(dá)到最大值73.48%。經(jīng)GraphPad Prism V5.01軟件計(jì)算得到山稔葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的IC50（半數(shù)抑制濃度）為9.797μg/mL，而VC為7.886μg/mL，清除效果略優(yōu)于山稔葉總黃酮。

圖12 山稔葉總黃酮及VC對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.12 Scavenging effect of total flavonoids and VCon DPPH

3 結(jié)論

3.1本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.5b軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化山稔葉總黃酮回流提取工藝。通過方差分析可知，各因素對(duì)山稔葉總黃酮提取率的影響作用為：提取溫度＞提取時(shí)間＞液固比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。山稔葉總黃酮回流提取的最優(yōu)工藝條件為：提取溫度73℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液固比19∶1（mL/g）、提取時(shí)間124min。在此條件下總黃酮的提取率（5.426%）與預(yù)測(cè)值基本相符。

3.2山稔葉總黃酮具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，其IC50為9.797μg/mL，與天然抗氧化劑VC（IC50=7.886μg/mL）相近。本研究為合理開發(fā)利用山稔葉資源提供了理論依據(jù)。

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Optimization of extracting total flavonoids from leaves of Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk by response surface methodology

WU Ping-ping，LAI Man-ping，YIN Yan-yan，HUANG Ru-qiang
（College of Life Science，South China Normal University，Guangzhou 510631，China）

Based on single factor experiments，extraction conditions concluding extraction temperature，ethanol concentration，liquid-solid ratio and extraction time were optimized using response surface methodology.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows：extraction temperature 73℃，ethanol concentration 50%，liquid-solid ratio 19∶1（mL/g）and extraction time 124min，resulting in an extraction efficiency of 5.426%for total flavonoids which was consistent with the predicted value.In addition，total flavonoids from leaves of R.tomentosa had scavenging effect on DPPH with a dose-effect relationship，and the IC50was 9.797μg/mL.

leaves of R.tomentosa；total flavonoids；response surface；DPPH

TS255.1

B

1002-0306（2014）04-0223-06

2013－08－02

吳萍萍（1988-），女，碩士研究生在讀，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。

廣東省農(nóng)業(yè)攻關(guān)計(jì)劃（2006B20401017）。