響應(yīng)面法優(yōu)化毛葉藜蘆環(huán)巴胺的提取工藝

溫 文，薛 兵，康靜靜，劉崇波，溫輝梁，*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌航空大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西南昌330063）

響應(yīng)面法優(yōu)化毛葉藜蘆環(huán)巴胺的提取工藝

溫 文1，薛 兵1，康靜靜1，劉崇波2，溫輝梁1，*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌航空大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西南昌330063）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化了從毛葉藜蘆中提取環(huán)巴胺的條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取提取液料比，提取時(shí)間和提取溫度為隨機(jī)因子，以環(huán)巴胺提取量為響應(yīng)值，建立三因素三水平Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，并建立數(shù)學(xué)模型對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行分析。結(jié)果表明，提取液料比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)環(huán)巴胺的提取量都有極顯著（p＜0.01）的影響，并確定了最佳的提取工藝參數(shù)為：提取液料比9∶1（mL/g），提取時(shí)間10.0h，提取溫度48.0℃。在此優(yōu)化條件下，提取10.0g毛葉藜蘆得到環(huán)巴胺的理論量為9.38mg，實(shí)際提取量為9.19mg，相對(duì)誤差為2.02%。

環(huán)巴胺，響應(yīng)面法，優(yōu)化

藜蘆為百合科植物，為有毒中藥，世界上約有40種，據(jù)《中國(guó)植物志》記載，我國(guó)有其中13種和1個(gè)變種[1]。我國(guó)盛產(chǎn)藜蘆，作為中藥用于中風(fēng)痰壅，癲癇、喉痹不通，及疥癬和惡瘡[2-4]。而通過(guò)長(zhǎng)期研究，Keeler等[5]在羊群食用的藜蘆屬植物山藜蘆（Veratrum californicum）中找到了一種甾體類(lèi)生物堿環(huán)巴胺。直到90年代中期，環(huán)巴胺被發(fā)現(xiàn)是一種Hedgehog信號(hào)通路的抑制劑[6]，Hedgehog信號(hào)通路的突變與多種腫瘤的發(fā)病有關(guān)聯(lián)，人們發(fā)現(xiàn)環(huán)巴胺對(duì)多種腫瘤如母髓質(zhì)細(xì)胞瘤、基底細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、橫紋肌肉瘤、小細(xì)胞肺癌、消化道腫瘤、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌等均有顯著的抑制活性[7]，對(duì)銀屑病也有療效[8]。因此，以環(huán)巴胺開(kāi)發(fā)新型抗癌藥物在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，環(huán)巴胺已經(jīng)成為新藥開(kāi)發(fā)的重要研究目標(biāo)。

目前環(huán)巴胺的來(lái)源主要有三種途徑，一是從植物中提取[9]，雖然含量較低，但是藜蘆屬植物在我國(guó)含量豐富，提取的方法經(jīng)濟(jì)快速；二是全合成，全合成的過(guò)程復(fù)雜且立體選擇性差，產(chǎn)率很低，僅有1%左右[10]；三是半合成，通過(guò)對(duì)具有類(lèi)似環(huán)巴胺結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化或者結(jié)構(gòu)改造。張衛(wèi)東[11]對(duì)還原介芬胺得到環(huán)巴胺的方法進(jìn)行了改進(jìn)，提高了產(chǎn)率，但是沒(méi)有避免使用水合肼和高溫（200℃），條件苛刻不適合大量反應(yīng)，環(huán)巴胺的大量獲得還是受到了限制。

為了增加環(huán)巴胺的抗腫瘤活性，人們對(duì)環(huán)巴胺進(jìn)行了一系列衍生，包括擴(kuò)環(huán)，環(huán)巴胺的3-位羥基氧化[12]，N-原子烷基化[13]細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分衍生物對(duì)Shh阻斷作用有顯著增加。Alfredo C C[14]將擴(kuò)環(huán)后化合物的3-位羥基氧化后再衍生出系列產(chǎn)品，然后將A環(huán)內(nèi)的雙鍵還原得到的新化合物的活性是還原前的10～30倍；同樣對(duì)環(huán)巴胺進(jìn)行相同處理達(dá)到的環(huán)巴胺衍生物活性是環(huán)巴胺的20倍。

本文對(duì)毛葉藜蘆中的環(huán)巴胺進(jìn)行提取優(yōu)化，并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面法對(duì)影響環(huán)巴胺提取量的主要因素進(jìn)行分析，從而確定最優(yōu)提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛葉藜蘆 四川荷花池中藥材專(zhuān)業(yè)批發(fā)市場(chǎng)肖草藥中藥行，產(chǎn)地四川；甲醇 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉 分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；乙腈 色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JJ-1型磁力攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；JJ-200型電子天平 常熟雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng)；島津LC-10AT型高效液相色譜儀 日本島津制造所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 環(huán)巴胺高效液相色譜檢測(cè)條件 運(yùn)用高效液相色譜對(duì)提取出來(lái)的環(huán)巴胺進(jìn)行檢測(cè)，其最優(yōu)條件為：色譜柱：WATO-54275 waters C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.01%三氟乙酸（A）和乙腈（B），梯度洗脫：0～16min（90%～65%A）；分析時(shí)長(zhǎng)：16min；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；柱溫：25℃。

1.2.2 環(huán)巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 配制濃度分別為：0.125、0.25、0.5、1、2mg/mL的環(huán)巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，利用高效液相色譜測(cè)定紫外吸收。

1.2.3 環(huán)巴胺提取量的計(jì)算 由高效液相色譜測(cè)得的峰面積根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出環(huán)巴胺濃度后，環(huán)巴胺含量按下式計(jì)算：

環(huán)巴胺含量（mg）=測(cè)量濃度（mg/mL）×樣品體積（mL）

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將10g毛葉藜蘆粉碎，以甲醇為提取溶劑，在液料比4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1（mL/g），提取時(shí)間2、4、6、8、10、12h，提取溫度25、30、35、40、45、50℃的條件下進(jìn)行提取，再將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，得到粗提物后用甲醇將粗提物定容于10mL容量瓶中，并用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用Deign-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面法的提取優(yōu)化設(shè)計(jì)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析[15]。以環(huán)巴胺提取量為指標(biāo)，采用3因素3水平的Box-Behnken的中心設(shè)計(jì)組合[16]，對(duì)液料比、提取時(shí)間、提取溫度三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken的中心組合因素水平表Table.1 Factors and levels of Box-Behnken central component experiments design

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)用Deign-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面法的提取結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素對(duì)環(huán)巴胺提取的影響程度以及最優(yōu)的提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

環(huán)巴胺濃度為x，各個(gè)濃度紫外吸收峰面積為y，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y=0.7814x+0.0007，R2=0.9997（圖1）。

圖1 環(huán)巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Cyclopamine standard curve

2.2 環(huán)巴胺提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取液料比對(duì)環(huán)巴胺提取量的影響 固定提取溫度為30℃，提取時(shí)間為10h對(duì)環(huán)巴胺提取量進(jìn)行分析。從圖2中可以看出，隨著液料比的增大，環(huán)巴胺的提取量逐步增加，在液料比為8∶1時(shí)達(dá)到最大，再增加液料比，環(huán)巴胺的提取量變小。在最初時(shí)，隨著液料比變大，環(huán)巴胺在甲醇中的溶解量逐步增大，而在液料比達(dá)到8∶1之后，在提取時(shí)毛葉藜蘆中同屬于生物堿的藜蘆胺與環(huán)巴胺呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，在此液料比之后藜蘆胺競(jìng)爭(zhēng)性更強(qiáng)，使得環(huán)巴胺提取量變少，故選擇提取液料比為8∶1。

圖2 液料比對(duì)環(huán)巴胺提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on cyclopamine extraction

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)環(huán)巴胺提取量的影響 固定提取液料比為8∶1，提取溫度為30℃對(duì)環(huán)巴胺提取量進(jìn)行分析。從圖3可以看出，隨著提取時(shí)間的加長(zhǎng)，環(huán)巴胺的提取量增加，在10h時(shí)達(dá)到最大，但是之后隨之減小，是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使得環(huán)巴胺分解而降低得率，故選擇提取時(shí)間為10h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)環(huán)巴胺提取量的影響Fig.3 Effect of time on cyclopamine extraction

2.2.3 提取溫度對(duì)環(huán)巴胺提取量的影響 固定提取液料比為8∶1，提取時(shí)間為10h對(duì)環(huán)巴胺提取量進(jìn)行分析。從圖4中可以看出，隨著溫度的提高，環(huán)巴胺的提取量也在增大，這說(shuō)明環(huán)巴胺在溶劑中的溶解性增大，但考慮到環(huán)巴胺在高溫下容易變質(zhì)，而且提取量上升幅度已經(jīng)很小，從節(jié)能和防止變質(zhì)的基礎(chǔ)考慮，最佳提取溫度為45℃。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化環(huán)巴胺的提取條件

圖4 提取溫度對(duì)環(huán)巴胺提取量的影響Fig.4 Effect of time on cyclopamine extraction

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共有17個(gè)點(diǎn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，從而得到響應(yīng)回歸方程為：

Y=9.09+0.59A+0.28B+0.22C+0.26AB+0.46AC+ 0.43BC-0.76A2-0.72B2-0.48C2。

回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可以看出，以環(huán)巴胺提取量為響應(yīng)值時(shí)，模型p＜0.0001，表明該二次方程模型極顯著。同時(shí)失擬項(xiàng)p=0.5258＞0.1，不顯著，模型擬合度較好。該分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方法是可靠的，能很好的描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用該方程代替真實(shí)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析是可行的。

各因素對(duì)環(huán)巴胺提取率的影響程度大小依次為：A（提取液料比）（p＜0.0001，極顯著）＞B（提取時(shí)間）（p=0.0009，極顯著）＞C（提取溫度）（p=0.0035，極顯著）。由方差分析可知，AB、BC、AC之間交互作用都極顯著，即提取液料比與提取時(shí)間、提取液料比與提取溫度、提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對(duì)環(huán)巴胺提取量都有極顯著的影響，繪制響應(yīng)曲面圖，如圖5～圖7所示。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table.2 Arrangement and results of the three-variable/threelevel central composite design

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析表Table.3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

由圖5可知，液料比（A）與時(shí)間（B）的等高線(xiàn)呈橢圓形，響應(yīng)面走勢(shì)陡峭，說(shuō)明一次項(xiàng)A、B對(duì)Y有極顯著的影響。環(huán)巴胺的提取量隨著提取液料比增大和提取時(shí)間加長(zhǎng)先增大后減少，且提取量在提取液料比約為8.5∶1提取時(shí)間約為10.5h時(shí)候達(dá)到最大；同理，由圖6可知，一次項(xiàng)A、C對(duì)Y有極顯著影響，提取量在提取料液比約為8.5∶1提取溫度約為45℃時(shí)達(dá)到最大；由圖7可知，一次項(xiàng)B、C對(duì)Y有極顯著的影響，提取量在提取時(shí)間約為10.5h提取溫度約為45℃時(shí)達(dá)到最大。

圖5 提取液料比與提取時(shí)間交互作用對(duì)環(huán)巴胺提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph of effct of liquid-to-material ratio and extraction time interaction on the cyclopamine extraction

圖6 提取液料比與提取溫度交互作用對(duì)環(huán)巴胺提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph of effct of liquid-to-material ratio and extraction temperature interaction on the cyclopamine extraction

圖7 提取時(shí)間與提取溫度交互作用對(duì)環(huán)巴胺提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface graph of effct of extraction time and extraction temperature interaction on the cyclopamine extraction

由軟件分析得出優(yōu)化的參數(shù)為：提取液料比為9.11∶1（mL/g）；提取時(shí)間為10.31h；提取溫度為48.36℃，此時(shí)環(huán)巴胺提取量為9.38mg。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化環(huán)巴胺提取工藝的可靠性，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作性，將優(yōu)化后的工藝參數(shù)調(diào)整為料液比9∶1（mL/g）、提取時(shí)間為10.0h、提取溫度為48.0℃。進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，環(huán)巴胺平均提取量為9.19mg，相對(duì)誤差為2.02%，說(shuō)明響應(yīng)面法得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了毛葉藜蘆中環(huán)巴胺的提取工藝。由方差分析得知，各因素對(duì)環(huán)巴胺的提取量有極顯著的影響（p＜0.01），影響次序?yàn)椋篈（提取料液比）＞B（提取時(shí)間）＞C（提取溫度）。最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為料液比9∶1（mL/g）、提取時(shí)間為10.0h、提取溫度為48.0℃，環(huán)巴胺平均提取量為9.19mg，與理論值9.38mg相差2.02%，兩者吻合較好，說(shuō)明響應(yīng)面法得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

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Optimization of cyclopamine extraction from Veratrum grandiflorum Loes by response surface methodology

WEN Wen1，XUE Bing1，KANG Jing-jing1，LIU Chong-bo2，WEN Hui-liang1，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.School of Environment and Chemical Engineering，Nanchang Hangkong University，Nanchang 330063，China）

Response surface methodology was used to optimize the extraction conditions of cyclopamine from Veratrum grandiflorum.Based on single factor experiments，the liquid-to-material ratio extraction time，extraction temperature were chosen as causal factors and the extraction of cyclopamine was chosen as response value which was then analyzed by models.In this way，the three-factors-three-levels Box-Behnken central composition experiments were designed.Results showed that liquid-to-material ratio，extraction time，extraction temperature had significant effects（p＜0.01）on extraction of cyclopamine.Optimal conditions for achieving the high extraction of cyclopamine were liquid-to-material ratio 9∶1（mL/mg），extraction time 10.0h，extraction temperature 48.0℃. Under these optimized conditions，with 10.0g raw materials extraction get cyclopamine 9.38mg in the abstract，the actual extraction of cyclopamine was 9.19mg，and the model prediction was worth 2.02 percent error.

cyclopamine；response surface methodology；optimization

TS201.1

B

1002-0306（2014）04-0219-04

2013－06－06 *通訊聯(lián)系人

溫文（1988-），男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21264011，20961007）。