大鼠糞便中細(xì)菌基因組DNA提取方法的比較

騫 宇，趙 欣

（重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶400067）

大鼠糞便中細(xì)菌基因組DNA提取方法的比較

騫 宇，趙 欣*

（重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶400067）

為獲得高質(zhì)量的腸道細(xì)菌基因組DNA，用于研究腸道菌群的多樣性，本實(shí)驗(yàn)分別采用改良的溶菌酶法和兩種試劑盒DNA提取法提取大鼠糞便中的細(xì)菌基因組DNA，通過(guò)DNA濃度和純度的測(cè)定、PCR-變性梯度凝膠電泳技術(shù)（PCR-DGGE技術(shù)）對(duì)提取效果進(jìn)行比較，以找到適合于糞便中細(xì)菌基因組DNA的提取方法。結(jié)果表明，改良的溶菌酶法提取的DNA質(zhì)量好，純度高，而且具有菌群多樣性豐富等特點(diǎn)，更適合用于腸道微生物菌群后續(xù)分子生物學(xué)研究。

細(xì)菌基因組DNA，大鼠糞便，腸道菌群，變性梯度凝膠電泳

腸道菌群是機(jī)體的重要組成部分，其菌群結(jié)構(gòu)數(shù)量和種類的變化與機(jī)體的健康和疾病有密切關(guān)系[1-3]，因此對(duì)腸道菌群的研究也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在腸道微生物研究中的廣泛運(yùn)用，提取到高質(zhì)量的細(xì)菌基因組DNA對(duì)于研究腸道微生物菌群來(lái)說(shuō)尤為關(guān)鍵。而DNA提取方法很多，傳統(tǒng)的DNA提取方法和各種試劑盒法的應(yīng)用都非常廣泛，但是大多數(shù)傳統(tǒng)方法繁瑣復(fù)雜，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，現(xiàn)在提取哺乳動(dòng)物腸道微生物菌群基因組DNA的主要方法是用傳統(tǒng)的溶菌酶法、酚/氯仿抽提法等，而這些方法提取的DNA純度低，含的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較多，嚴(yán)重影響后續(xù)的分子生物學(xué)方法的準(zhǔn)確性。而很多DNA提取試劑盒的價(jià)格昂貴，提取出來(lái)的DNA產(chǎn)量相對(duì)較低，效果不理想。目前，很多學(xué)者都提出了針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)樣品的傳統(tǒng)DNA提取法的改良方法[4-6]，但是關(guān)于實(shí)驗(yàn)室常用實(shí)驗(yàn)大鼠糞便中細(xì)菌基因組DNA提取方法研究較少，而且現(xiàn)在還沒(méi)有專門(mén)用于從大鼠腸道中提取微生物基因組DNA的試劑盒[7]。因此，尋找一種適用于大鼠腸道細(xì)菌基因組DNA的提取方法，對(duì)于后續(xù)的腸道微生物多樣性的分子生物學(xué)研究非常有必要。

本實(shí)驗(yàn)分別采用改良的溶菌酶法，糞便基因組DNA試劑盒提取法和通用基因組DNA試劑盒提取法提取大鼠糞便中細(xì)菌基因組DNA，對(duì)DNA提取效果進(jìn)行比較，探尋適合于提取大鼠腸道微生物菌群DNA的快捷、經(jīng)濟(jì)、高效的方法，為后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品采集 采集大鼠新鮮糞便0.2g，放入2mL的無(wú)菌離心管中（取2份樣品），放置在-80℃冰箱中冷凍保存；糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱型） 北京天根生物技術(shù)有限公司；通用基因組DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；GelRed凝膠核酸染料 美國(guó)biotium公司；蛋白酶K、溶菌酶、過(guò)硫酸銨、TEMED 美國(guó)Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 美國(guó)Genview公司；PCR的試劑 中國(guó)大連TaKaRa公司；引物 均由上海生工合成。

紫外分光光度計(jì)（MiNi） 日本島津公司；制冰機(jī)（SIM-F140AY65） 日本三洋電器公司；凝膠成像系統(tǒng)、梯度PCR儀（S1000）、變性梯度凝膠電泳儀（DcodeSystemapparatus） 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 糞便中細(xì)菌基因組DNA的提取

1.2.1 樣品預(yù)處理[8]將200mg左右糞便樣品放入2mL離心管，加入1mL磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1mol/L，pH7.4），20μL 20%PVPP，充分振蕩混勻。室溫下2000r/min離心6min，取上清液。沉淀中再加入1mL PBS混勻，離心，取上清液，合并兩次上清液再3000r/min離心6min，取上清液，再12000r/min離心6min，收集沉淀。沉淀用PBS清洗一次。分別用下面的3種方法抽提DNA。

1.2.2 改良溶菌酶法 用傳統(tǒng)的溶菌酶法提取的基因組DNA的質(zhì)量少，而且含有的蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多[8]，故在傳統(tǒng)溶菌酶法中，加入裂解液Ⅰ和Ⅱ，有利于細(xì)胞的裂解，可獲得更多的DNA，并且用氯仿/異戊醇反復(fù)抽提，有利于去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，具體方法如下：在預(yù)處理的樣品中依次加入300μL裂解液Ⅰ（0.15mol/L NaCl，0.1mol/L Na2EDTA，pH8.0）、100mg/mL溶菌酶100μL、5μL蛋白酶K（10mg/mL），在37℃下225r/min振蕩1h；加入300μL裂解緩沖液Ⅱ（10%SDS，0.1mol/L NaCl，0.5mol/L Tris-HCl，pH8.0），50μL 20% PVPP，65℃保溫10min；加入750μL Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），混合振蕩2min，13000r/min離心8min。上清液轉(zhuǎn)入新的2mL離心管；加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）?；旌险袷?min，13000r/min離心8min，上清液轉(zhuǎn)入另一2mL離心管；加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉和2倍體積無(wú)水乙醇，-20℃沉淀2h；15000g/min離心15min，沉淀用70%冰乙醇洗滌一次，自然風(fēng)干；最后沉淀用50μL無(wú)菌去離子水溶解，-20℃保存。

1.2.3 糞便基因組DNA試劑盒提取法 將預(yù)處理的樣品，采用北京天根生物技術(shù)有限公司的糞便基因組DNA提取試劑盒提取樣品細(xì)菌基因組DNA。提取得到的DNA溶于50μL無(wú)菌去離子水中。

1.2.4 通用基因組DNA試劑盒提取法 將預(yù)處理的樣品，采用北京索萊寶科技有限公司的通用基因組DNA提取試劑盒提取樣品細(xì)菌基因組DNA。提取得到的DNA溶于50μL無(wú)菌去離子水中。

表1 細(xì)菌基因組DNA的濃度和純度Table.1 Bacterial genomic DNA of concentration and purity

1.3 糞便中細(xì)菌基因組DNA的純度和質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1 DNA提取效果及質(zhì)量的檢測(cè) 分別取三種方法提取得到的DNA樣品1μL，稀釋10倍，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的A260、A280和A260/A280值；同時(shí)取三種方法抽提獲得的DNA各5μL，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色，凝膠成像儀觀察分析。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

1.3.2.1 細(xì)菌基因組16S rDNA PCR擴(kuò)增 用16S rDNA通用引物[9-10]27f（5’-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行V3區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1500bp。25μL擴(kuò)增體系：1μL DNA模板，正向和反向引物各0.5μL，12.5μL 2×Taq PCR Master Mix，滅菌的超純水補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色，凝膠成像儀觀察分析。

1.3.2.2 細(xì)菌巢式PCR擴(kuò)增 為提高反應(yīng)的特異性，用另一對(duì)引物特異性擴(kuò)增位于第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段更小的DNA片斷，以保證擴(kuò)增片段的準(zhǔn)確性。以第一次PCR產(chǎn)物作為模板，用引物[10]338f（5’-ACT CCA CGG GAG GCA GCA G-3’）及518r（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’），并在引物338f的5’末端加上40bp的GC夾子（CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G），進(jìn)行擴(kuò)增。50μL擴(kuò)增體系：2μL DNA模板，正向和反向引物各1.0μL，25μL 2×Taq PCR Master Mix，滅菌的超純水補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)程序：94℃ 5min，94℃ 30s，65～55℃ 30s（每個(gè)循環(huán)降低0.5℃），72℃30s，20個(gè)循環(huán)，94℃30s，55℃30s，72℃30s，8個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色，凝膠成像儀觀察分析。

1.3.3 DGGE電泳分析 參照朱陽(yáng)玲等[11]的方法，采用Bio-Rad公司的DcodeTM通用突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)三種方法提取的細(xì)菌基因組DNA的巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離分析。采用10%（w/v）的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度范圍為35%～60%，電泳溫度60℃，恒壓200V下電泳4h。電泳結(jié)束后取出膠放入配制好的GelRed染液中，浸染30min，再使用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種方法獲得的細(xì)菌基因組DNA質(zhì)量比較

2.1.1 細(xì)菌基因組DNA的濃度和純度 由表1可知，用改良溶菌酶法得到的樣品細(xì)菌基因組DNA濃度最高，通用基因組DNA試劑盒提取法得到的樣品細(xì)菌基因組DNA濃度最低。兩種試劑盒法提取的大鼠糞便細(xì)菌基因組DNA的OD260/OD280的值均小于1.7，改良溶菌酶法提取的基因組DNA的OD260/OD280的值在1.9～2.0之間。正常DNA樣品的OD260/OD280值約為1.8～2.0，若OD260/OD280值小于1.8或大于2.0，說(shuō)明可能有蛋白污染或RNA污染[12-13]。因此改良溶菌酶法提取的基因組DNA純度較高，而兩種試劑盒法提取的基因組DNA都有不同程度的蛋白質(zhì)污染或RNA污染。

2.1.2 細(xì)菌基因組DNA的電泳 如圖1所示，所得DNA樣品均大于23kbp，說(shuō)明這三種方法都能提取出細(xì)菌基因組DNA，1、2泳道條帶清晰且亮度較高，說(shuō)明改良后的溶菌酶法DNA提取效果最好；3、4泳道條帶亮度稍弱，5、6泳道條帶亮度相對(duì)最弱，表明用兩種基因組DNA提取試劑盒法提取的樣品基因組DNA純度跟改良后的溶菌酶法提取相比稍差，且得率較低。這與表1所顯示的信息是一致的，說(shuō)明改良后的溶菌酶法提取樣品細(xì)菌基因組DNA效果最好。

圖10 .8%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 0.8%agarose gel electrophoresis figure

2.2 細(xì)菌基因組DNA的16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1 第一次PCR擴(kuò)增結(jié)果 由圖2可見(jiàn)，對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，陰性對(duì)照無(wú)條帶，說(shuō)明擴(kuò)增無(wú)污染；1～6泳道均得到長(zhǎng)度約1500bp的特異性擴(kuò)增片段，符合預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。而且3、4泳道亮度很強(qiáng)，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物較多，效果較好。

圖2 細(xì)菌16S rDNA第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electropherogram of First PCR amplication of16S rDNA of bacteria

2.2.2 巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果 如圖3所示，陰性對(duì)照無(wú)條帶，說(shuō)明擴(kuò)增無(wú)污染，1～6泳道均擴(kuò)增出長(zhǎng)度約200bp的片段，條帶清晰，無(wú)雜帶，證明PCR效果較好。亮度為5，6泳道＞1，2泳道＞3，4泳道，說(shuō)明改良溶菌酶法提取的DNA質(zhì)量最好。

本實(shí)驗(yàn)證明改良溶菌酶法提取糞便樣品中的細(xì)菌基因組DNA的濃度和純度均優(yōu)于兩種試劑盒法。

2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE）結(jié)果分析

如圖4所示，1、2泳道顯現(xiàn)出的條帶最多，其次是5、6泳道，3、4泳道顯現(xiàn)出的條帶最少，說(shuō)明改良溶菌酶法提取的DNA樣品的菌群多樣性豐富，糞便基因組DNA提取試劑盒法次之，通用基因組DNA提取試劑盒法效果不太理想。

圖3 細(xì)菌16S rDNA巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electropherogram of Nested-PCR amplication of 16S rDNA of bacteria

圖4 細(xì)菌巢式PCR產(chǎn)物的水平變性梯度凝膠電泳圖譜Fig.4 DGGE profile of bacterial Nested-PCR amplication

3 討論

動(dòng)物和人都是由宿主自身及其體內(nèi)定植的微生物菌群共同組成的超級(jí)生物體。動(dòng)物和人體的健康狀況可由外界環(huán)境因子與機(jī)體自身及體內(nèi)的微生物菌群共同相互作用決定，因此研究宿主與體內(nèi)菌群之間的相作關(guān)系等具有重大的意義。糞便與腸道內(nèi)容物相似，含有大量的微生物、植物和腸道脫落細(xì)胞等，將糞便微生物作為研究對(duì)象，有利于更好地研究腸道微生物[14]。而且糞便取樣方便、無(wú)損傷。很多研究人員都選擇從動(dòng)物糞便中提取出細(xì)菌基因組DNA運(yùn)用于腸道微生物的研究。但由于糞便成分復(fù)雜，不同的細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分和結(jié)構(gòu)不一樣，且糞便中伴有各種Taq酶抑制劑和膽紅素、膽鹽等DNA降解物[15]，對(duì)不同提取方法的敏感度也不一樣，所以不同的提取方法所獲得的基因組DNA有差異。而樣品DNA的提取是腸道微生物菌群后續(xù)分子研究中最關(guān)鍵、最重要的一步，提取時(shí)不僅要盡可能地將樣品中所有細(xì)菌的基因組DNA提取出來(lái)，保證DNA的質(zhì)量和數(shù)量，而且要盡量去除其中抑制分子克隆中多種酶活性的雜質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)的目的是希望從大鼠糞便樣品中獲得高濃度、高純度的，并且能夠盡量全面的反映出樣品中菌群多樣性的細(xì)菌基因組DNA。根據(jù)紫外分光光度法、DNA樣品的電泳圖和PCR擴(kuò)增圖，發(fā)現(xiàn)改良溶菌酶法提取的細(xì)菌基因組DNA的濃度和純度均高于其他兩種方法提取的DNA。因DGGE圖譜能夠比較直觀地反映細(xì)菌菌群的多樣性，故采用PCR-DGGE技術(shù)從細(xì)菌多樣性的角度評(píng)價(jià)DNA提取方法的優(yōu)劣。通過(guò)3種方法得到的同一份糞便樣品的DGGE圖譜差異較大，說(shuō)明在腸道菌群的分子生態(tài)研究中，DNA提取的方法會(huì)影響我們對(duì)菌群多樣性的分析，甚至引起誤差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明改良溶菌酶法比糞便基因組DNA提取試劑盒法和通用基因組DNA提取試劑盒法提取的細(xì)菌基因組DN的純度和質(zhì)量更好，且能夠觀察到糞便中菌群的多樣性更豐富，所以更合適腸道菌群多樣性的研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中使用的三種方法均能夠從大鼠糞便中提取到細(xì)菌基因組DNA，通過(guò)紫外分光光度法、PCRDGGE等方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，相對(duì)于兩種試劑盒DNA提取法，改良溶菌酶法提取的大鼠糞便細(xì)菌基因組DNA的純度更高、質(zhì)量更好，而且能夠觀察到更高的多樣性，所以更合適腸道菌群后續(xù)分子生物學(xué)研究。

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A comparison of methods for the extraction of bacterial genomic DNA in rat feces

QIAN Yu，ZHAO Xin*
（Department of Biological and Chemical Engineering，Chongqing University of Education，Chongqing 400067，China）

In order to obtain high-quality bacterial genomic DNA，and to study the diversity of the intestinal flora，improved lysozyme method，and two kinds of DNA extraction kits were used to extract bacterial genomic DNA in rat feces.These extraction techniques were compared through measuring DNA concentration and purity，and PCR-DGGE technique to find the best method for extracting bacterial genomic DNA in rat feces.Results showed that bacterial genomic DNA was extracted by improved lysozyme method had better quality and purity，and diversity of flora.It was more suitable for the subsequent intestinal microflora molecular biology research.

bacterial genomic DNA；rat feces；gut microflora；denaturant gradient gel electrophoresis（DGGE）

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0166-04

2013－07－16 *通訊聯(lián)系人

騫宇（1976-），女，博士，講師，研究方向：食品科學(xué)。

重慶市科委自然科學(xué)基金項(xiàng)目（cstc2011jjA80001）。