增殖誘導(dǎo)配體在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及臨床意義

張桂華　陳令松　張秋榮等

[摘要] 目的 定量分析多發(fā)性骨髓瘤患者化療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞和血漿中增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）mRNA及蛋白的表達(dá)水平。方法 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RFQ-PCR）技術(shù)測(cè)定靶基因及靶蛋白的準(zhǔn)確含量。 結(jié)果 MM患者化療前APRIL mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照（P<0.05）；化療前Ⅲ期APRIL mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于Ⅰ期及Ⅱ期（P<0.05）；化療后PD組顯著高于CR及PR組（P<0.05）。 結(jié)論 APRIL可能參與MM的發(fā)生與發(fā)展并與腫瘤負(fù)荷量及療效密切相關(guān)， 其mRNA與蛋白表達(dá)水平相一致，且可能成為有效治療MM的新靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 增殖誘導(dǎo)配體；多發(fā)性骨髓瘤；靶點(diǎn)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R733.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）04-0011-03

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種以骨髓中漿細(xì)胞惡性克隆性增殖為特征的B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤，與骨髓基質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)。其自分泌或旁分泌的可溶性細(xì)胞因子等瀑布式激活多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，同時(shí)可能增加的基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生成[1]。這些細(xì)胞因子中即包括增殖誘導(dǎo)配體（a proliferation-inducing ligand， APRIL），其為T(mén)NF家族新成員， 因具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用而命名，為幼稚、未成熟及活化B淋巴細(xì)胞的主要存活因子之一[2，3]。在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞受外源性刺激激活的各種信號(hào)途徑中，NF-кB 途徑可能是最主要的途徑之一。目前研究已證實(shí)，能直接激活NF-кB途徑的APRIL，已經(jīng)被確認(rèn)是多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的主要存活因子及生長(zhǎng)因子，骨髓瘤細(xì)胞系及幼稚骨髓瘤細(xì)胞高表達(dá)APRIL及其體[1，4，5]。APRIL被發(fā)現(xiàn)具有保護(hù)MM、B-CLL細(xì)胞避免自發(fā)性凋亡及藥物誘導(dǎo)性凋亡作用，同時(shí)可提高其細(xì)胞存活能力[6]。故目前認(rèn)為，對(duì)APRIL的研究極有可能成為腫瘤，尤其是B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤研究的新方向。

本研究采用ELISA及RFQ-PCR技術(shù)，測(cè)定不同分期MM首次就診及應(yīng)用一周期VAD方案化療后患者外周血血漿中APRIL蛋白及單個(gè)核細(xì)胞中APRIL mRNA的表達(dá)情況，并歸納總結(jié)APRIL表達(dá)與MM不同分期及化療前后間的關(guān)系，以期在MM早期診斷、早期治療、預(yù)測(cè)疾病活動(dòng)以及尋找預(yù)后生物參數(shù)等方面發(fā)揮重要作用，并為臨床治療新方法提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

62份標(biāo)本均取自徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院、南通大學(xué)附屬醫(yī)院、第二附屬醫(yī)院血液科2008年4月～2012年5月住院的31例初診及一周期VAD方案化療后患者外周血。其中男22例， 女9例，中位年齡65歲（46～82歲）。MM Ⅰ期6例，Ⅱ期9期，Ⅲ期16例，其中A組12例，B組19例。15份健康供者標(biāo)本，中位年齡69歲（55～80歲）。MM分型、療效標(biāo)準(zhǔn)及疾病診斷采用《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》，由張之南主編。MM分期按國(guó)際分期系統(tǒng)（ISS）進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶； pGEM-T載體試劑盒；Trizol 試劑；X-gal、Taq DNA聚合酶；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen公司）；DL-2000；膠回收試劑盒；ELISA試劑盒、核酸蛋白紫外分析儀、熒光定量PCR儀、全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1制備標(biāo)本 取化療前及后患者外周血6 mL，應(yīng)用EDTA抗凝， 2 mL提取血漿，4 mL分離出單個(gè)核細(xì)胞。

1.3.2設(shè)計(jì)探針及引物 據(jù)注冊(cè)號(hào)為NM012512的β2微球蛋白（β2M） 全序列（內(nèi)參）和APRIL （注冊(cè)號(hào)為AF04688 ），設(shè)計(jì)相應(yīng)引物和熒光探針并合成。

1.3.3 構(gòu)建增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）及內(nèi)參β2微球蛋白（β2M）標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)胞總RNA經(jīng)Trizol法提取后檢測(cè)其濃度和純度，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， cDNA進(jìn)行擴(kuò)增目的片段，膠回收電泳PCR產(chǎn)物與T載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選出重組質(zhì)粒，提取出小量，陽(yáng)性克隆經(jīng)EcoRⅠ酶切鑒定、測(cè)序分析證實(shí)后進(jìn)一步擴(kuò)增，質(zhì)粒抽提，再經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀定量，按倍比稀釋后保存。

1.3.4 RFQ-PCR檢測(cè)mRNA含量 在離心管中加入反應(yīng)體系，并設(shè)5個(gè)APRIL或β2M標(biāo)準(zhǔn)品、空白管及陰性管各3個(gè)復(fù)孔作為對(duì)照。PCR 擴(kuò)增在熒光定量檢測(cè)儀中進(jìn)行。由電腦軟件計(jì)算出標(biāo)本中β2M或APRIL mRNA值， 將APRIL與β2M mRNA比值定為評(píng)估APRIL mRNA表達(dá)水平的標(biāo)值。

1.3.5 ELISA方法檢測(cè)APRIL蛋白含量 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行，測(cè)定靶蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Stata7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，正常對(duì)照及MM患者化療前不同分期、MM患者化療后不同療效APRIL mRNA和蛋白的表達(dá)比較均采用單因素方差分析，如差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步兩兩比較采用Scheffe法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的純度和質(zhì)量

細(xì)胞總RNA檢測(cè)表明，提示質(zhì)量及完整性均良好。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)， 結(jié)果表明片段大小符合預(yù)期值。

2.3 鑒定陽(yáng)性克隆

將藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選出的重組質(zhì)粒， 抽提出小量，EcoRⅠ酶切鑒定陽(yáng)性克隆后測(cè)序分析，顯示與β2M及APRIL的基因序列相符，同源性達(dá)100%（封三圖1）。

2.4 ELISA檢測(cè)的線性關(guān)系

APRIL標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度與相應(yīng)OD值之間存在良好的線性相關(guān)（r=1%）。

2.5 增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）mRNA及蛋白測(cè)定結(jié)果（表1、2）

結(jié)果表明：對(duì)照組與MM患者化療前各期APRIL mRNA及蛋白表達(dá)均采用單因素方差分析比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（APRIL mRNA F=4.28，P=0.0275； APRIL蛋白F=5.11，P=0.0157），Scheffe法進(jìn)一步兩兩比較顯示：各期mRNA及蛋白水平均顯著高于正常對(duì)照（P<0.05），且Ⅲ期APRIL mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期（P<0.05）；化療后不同療效組APRIL mRNA及蛋白表達(dá)均采用單因素方差分析比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（APRIL mRNA F=7.53，P=0.0143；APRIL蛋白F=8.27，P=0.0126），Scheffe法進(jìn)一步兩兩比較表明：CR及PR組mRNA及蛋白表達(dá)均顯著低于PD組（P<0.05）。

3 討論

在過(guò)去的幾年中，努力尋找識(shí)別MM高危人群的預(yù)后指標(biāo)及明確促進(jìn)MM細(xì)胞惡性增殖及耐藥發(fā)生的一系列復(fù)雜機(jī)制的研究已大量開(kāi)展，最近研究顯示，APRIL在B細(xì)胞的生成、免疫耐受及惡性克隆性增殖等方面均發(fā)揮重要作用[6，7]。在正常生理狀態(tài)下，APRIL是骨髓中漿細(xì)胞不可缺少的生存因子[5]。研究顯示，分泌大量APRIL的巨核細(xì)胞[8]，對(duì)漿細(xì)胞而言是必不可少的骨髓組成部分，間接表明漿細(xì)胞存活有賴(lài)于APRIL[9]。這些選擇性局灶性分泌的APRIL可能對(duì)骨髓中淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的存活起至關(guān)重要的作用[10]。多項(xiàng)研究已證實(shí)APRIL在腫瘤疾病中發(fā)揮重要作用，尤其是B細(xì)胞惡性腫瘤[11，12]。人APRIL 轉(zhuǎn)染的小鼠，大約40%最終發(fā)展為類(lèi)似于B-CLL的B1細(xì)胞惡性腫瘤[11]。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，MM患者APRIL血清蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[10，13]，且APRIL mRNA表達(dá)與蛋白水平表達(dá)一致。更重要的是，我們證實(shí)，MM分期越高，其APRIL mRNA及蛋白表達(dá)水平越高，Ⅲ期明顯高于Ⅰ期及Ⅱ期，化療后表達(dá)水平下降，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[10]，具體數(shù)據(jù)另篇文章詳細(xì)敘述。我們進(jìn)一步將化療后不同療效進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，PD組顯著高于CR及PR組（P<0.05） ，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[10]。提示APRIL表達(dá)的變化存在于MM發(fā)生、發(fā)展的臨床全過(guò)程，可能參與MM的發(fā)生與發(fā)展并可反映MM腫瘤負(fù)荷量及療效，是輔助判斷MM緩解狀態(tài)的有用指標(biāo)，其可能是MM的主要促瘤因子。研究顯示，化療前高表達(dá)APRIL患者無(wú)病生存期縮短[10]，表明APRIL可能成為判斷疾病預(yù)后的生物因子。研究證實(shí)，MM微環(huán)境中的破骨細(xì)胞通過(guò)旁分泌的方式產(chǎn)生大量的APRIL促進(jìn)骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]，其可能會(huì)成為MM及其他B細(xì)胞惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。目前已有研究[15]采用抗APRIL抗體阻斷其與相應(yīng)受體-BCMA及TACI相結(jié)合，以抑制其因APRIL誘導(dǎo)的增殖、存活作用。

總之，我們的結(jié)果已顯示，APRIL mRNA及蛋白水平表達(dá)可能是一個(gè)提示MM疾病活動(dòng)和進(jìn)展的有用的生物學(xué)指標(biāo)。治療前APRIL表達(dá)水平可能成為提示MM無(wú)進(jìn)展生存期的預(yù)測(cè)因子。APRIL水平檢測(cè)可以作為MM的提前診斷、早期治療及預(yù)后的新指標(biāo)，且可能成為有效治療的新靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Caers J， Van Valckenborgh E， Menu E，et al. Unraveling the biology of multiple myeloma disease： cancer stem cells， acquired intracellular changes and interactions with the surrounding microenvironment[J]. Bull Cancer，2008， 95：301-313.

[2] Schneider P， MacKay F， Steiner V， et al. BAFF，a novel ligand of the tumor necrosis factor family， stimulates B cell growth[J]. J Exp Med，1999，189（11）：1747-1756.

[3] Tai YT， Li XF， Breitkreutz I， et al. Role of B-cell-activating factor in adhesion and growth of human multiple myeloma cells in the bone marrow microenvironment[J]. Cancer Res，2006，66（13）：6675-6682.

[4] Mitsiades CS， Mitsiades N， Poulaki V，et al. Activation of NF-kappa B and upregulation of intracellular antiapoptotic proteins via the IGF-1/Akt signaling in human multiple myeloma cells： therapeutic implications[J]. Oncogene，2002，21（37）：5673-5683.

[5] Novak AJ， Darce JR， Arendt BK， et al. Expression of BCMA， TACI， and BAFF-R in multiple myeloma： a mechanism for growth and survival[J]. Blood，2004，103：689-694.

[6] Kern C， Cornuel JF， Billard C， et al. Involvement of BAFF and APRIL in the resistance to apoptosis of B-CLL through an autocrine pathway[J]. Blood，2004，103： 679-688.

[7] Briones J， Timmerman JM， Hilbert DM，et al. BLyS and BLyS receptor expression in non-Hodgkins lymphoma[J]. Exp Hematol， 2002，30：135-141.

[8] Bonci D， Hahne M， Felli N，et al. Potential role of APRIL as autocrine growth factor for megakaryocytopoiesis[J]. Blood，2004，104（10）：3169-3172.

[9] Winter O， Moser K， Mohr E，et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow[J]. Blood， 2010，116（11）：1867-1875.

[10] Dorota Lemancewicza， Lukasz Bolkunb， Ewa Jablonskac， et al. Evaluation of TNF superfamily molecules in multiple myeloma patients：Correlation with biological and clinical features[J]. Leukemia Research，2013，5（14）：1-5.

[11] Dillon S， Gross J， Ansell SM，et al. An APRIL to remember： novel TNF ligands as therapeutic targets[J]. Nat Rev，2006，5：235-246.

[12] Hendriks J， Planelles L， De Jong-Odding J，et al. Heparan sulphate proteoglycan binding promotes APRIL-induced tumor cell proliferation[J]. Cell Death Diff，2005， 12：637-648.

[13] Fragioudaki M， Tsirakis G， Pappa CA， et al. Serum BAFF levels are related to angiogenesis and prognosis in patients with multiple myeloma[J]. Leuk Res，2012，36（8）：1004-1008.

[14] Breitkreutz I，Raab MS，Vallet S，et al. Targeting MEK1/2 blocks osteoclast differentiation function and cytokine secretion in multiple myeloma[J]. Br J H aematol，2007， 139：55-63.

[15] Marco Guadagnoli， Fiona Kimberley， Uyen Phan， et al. Development and characterization of APRIL antagonistic monoclonal antibodies for treatment of B-cell lymphomas[J]. Blood，2011， 69：2900-2905.

（收稿日期：2013-11-18）

[6] Kern C， Cornuel JF， Billard C， et al. Involvement of BAFF and APRIL in the resistance to apoptosis of B-CLL through an autocrine pathway[J]. Blood，2004，103： 679-688.

[7] Briones J， Timmerman JM， Hilbert DM，et al. BLyS and BLyS receptor expression in non-Hodgkins lymphoma[J]. Exp Hematol， 2002，30：135-141.

[8] Bonci D， Hahne M， Felli N，et al. Potential role of APRIL as autocrine growth factor for megakaryocytopoiesis[J]. Blood，2004，104（10）：3169-3172.

[9] Winter O， Moser K， Mohr E，et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow[J]. Blood， 2010，116（11）：1867-1875.

[10] Dorota Lemancewicza， Lukasz Bolkunb， Ewa Jablonskac， et al. Evaluation of TNF superfamily molecules in multiple myeloma patients：Correlation with biological and clinical features[J]. Leukemia Research，2013，5（14）：1-5.

[11] Dillon S， Gross J， Ansell SM，et al. An APRIL to remember： novel TNF ligands as therapeutic targets[J]. Nat Rev，2006，5：235-246.

[12] Hendriks J， Planelles L， De Jong-Odding J，et al. Heparan sulphate proteoglycan binding promotes APRIL-induced tumor cell proliferation[J]. Cell Death Diff，2005， 12：637-648.

[13] Fragioudaki M， Tsirakis G， Pappa CA， et al. Serum BAFF levels are related to angiogenesis and prognosis in patients with multiple myeloma[J]. Leuk Res，2012，36（8）：1004-1008.

[14] Breitkreutz I，Raab MS，Vallet S，et al. Targeting MEK1/2 blocks osteoclast differentiation function and cytokine secretion in multiple myeloma[J]. Br J H aematol，2007， 139：55-63.

[15] Marco Guadagnoli， Fiona Kimberley， Uyen Phan， et al. Development and characterization of APRIL antagonistic monoclonal antibodies for treatment of B-cell lymphomas[J]. Blood，2011， 69：2900-2905.

（收稿日期：2013-11-18）

[6] Kern C， Cornuel JF， Billard C， et al. Involvement of BAFF and APRIL in the resistance to apoptosis of B-CLL through an autocrine pathway[J]. Blood，2004，103： 679-688.

[7] Briones J， Timmerman JM， Hilbert DM，et al. BLyS and BLyS receptor expression in non-Hodgkins lymphoma[J]. Exp Hematol， 2002，30：135-141.

[8] Bonci D， Hahne M， Felli N，et al. Potential role of APRIL as autocrine growth factor for megakaryocytopoiesis[J]. Blood，2004，104（10）：3169-3172.

[9] Winter O， Moser K， Mohr E，et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow[J]. Blood， 2010，116（11）：1867-1875.

[10] Dorota Lemancewicza， Lukasz Bolkunb， Ewa Jablonskac， et al. Evaluation of TNF superfamily molecules in multiple myeloma patients：Correlation with biological and clinical features[J]. Leukemia Research，2013，5（14）：1-5.

[11] Dillon S， Gross J， Ansell SM，et al. An APRIL to remember： novel TNF ligands as therapeutic targets[J]. Nat Rev，2006，5：235-246.

[12] Hendriks J， Planelles L， De Jong-Odding J，et al. Heparan sulphate proteoglycan binding promotes APRIL-induced tumor cell proliferation[J]. Cell Death Diff，2005， 12：637-648.

[13] Fragioudaki M， Tsirakis G， Pappa CA， et al. Serum BAFF levels are related to angiogenesis and prognosis in patients with multiple myeloma[J]. Leuk Res，2012，36（8）：1004-1008.

[14] Breitkreutz I，Raab MS，Vallet S，et al. Targeting MEK1/2 blocks osteoclast differentiation function and cytokine secretion in multiple myeloma[J]. Br J H aematol，2007， 139：55-63.

[15] Marco Guadagnoli， Fiona Kimberley， Uyen Phan， et al. Development and characterization of APRIL antagonistic monoclonal antibodies for treatment of B-cell lymphomas[J]. Blood，2011， 69：2900-2905.

（收稿日期：2013-11-18）