新疆小反芻獸疫疫情診斷

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（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家外來動(dòng)物疫病診斷中心，山東青島　266032；2.新疆伊犁州動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆伊犁　835000；3. 新疆伊犁州霍城縣畜牧獸醫(yī)站，新疆霍城　835200；4. 新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊　830000）

新疆小反芻獸疫疫情診斷

王清華1，劉春菊1，吳曉東1，王華1，王明國(guó)2，王永生2，田建龍3，盛卓君4，林漢亮4，馬偉4，李林1，任煒杰1，王淑娟1，趙文年1，包靜月，王志亮

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家外來動(dòng)物疫病診斷中心，山東青島266032；2.新疆伊犁州動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆伊犁835000；3. 新疆伊犁州霍城縣畜牧獸醫(yī)站，新疆霍城835200；4. 新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊830000）

2013年12月新疆伊犁州霍城縣發(fā)生不明山羊疫情，根據(jù)臨床癥狀和剖檢變化懷疑為小反芻獸疫感染。對(duì)3只病死山羊病料、8只患病山羊分泌物棉拭子樣品和6只患病山羊血清樣品分別進(jìn)行病原學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)。利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒對(duì)6份血清樣本進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果全部為陽性。利用抗原捕獲ELISA試劑盒，在11只病羊 樣品中都檢測(cè)到小反芻獸疫抗原。利用能特異性檢測(cè)小反芻獸疫病毒的熒光定量RT—PCR方法，在11只病羊樣品中檢測(cè)到小反芻獸疫病毒核酸。利用特異引物進(jìn)行PPRV N基因片段RT—PCR反應(yīng)，從11只病羊樣品中檢測(cè)到PPRV核酸。針對(duì)2號(hào)樣本病原核酸N基因和F基因片段進(jìn)行序列同源性比較，結(jié)果該毒株與西藏流行株序列片段相似性分別為96.5%和97.5%。遺傳進(jìn)化分析，該病原屬于譜系4，與巴基斯坦等國(guó)流行毒株遺傳關(guān)系最近。

小反芻獸疫；小反芻獸疫病毒；遺傳進(jìn)化分析

小反芻獸疫（Peste des Petits Ruminants， 簡(jiǎn)稱PPR）是一種感染山羊、綿羊和野生小反芻獸的嚴(yán)重的烈性、接觸性傳染病，特征為發(fā)熱、口腔及舌黏膜糜爛、流淚、流鼻液、腹瀉和肺炎。本病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列入一類動(dòng)物疫病。本病發(fā)病率可達(dá)100%，嚴(yán)重暴發(fā)期病死率為100%，中等暴發(fā)期病死率不超過50%。小反芻獸疫最早于1942年發(fā)生于西非，1970年至1972年間，PPR首次在東非國(guó)家蘇丹發(fā)生，1983年傳至阿拉伯半島，1987年傳至印度南部。在非洲，PPR流行于中部和北部非洲。在亞洲，PPR在中東、中亞和南部亞洲的大部分國(guó)家流行，對(duì)我國(guó)西部邊境省份形成包圍態(tài)勢(shì)[1]。從遺傳進(jìn)化關(guān)系上，PPRV可分為4個(gè)譜系，譜系4分布最廣，分布于南亞、中東和北部非洲，譜系3分布于中東和東非，譜系1和2僅見于非洲[2]。

2007年7—9月，我國(guó)西藏首次暴發(fā)PPR疫情[3]。該疫情涉及西藏阿里地區(qū)革吉縣、日土縣、扎達(dá)縣和改則縣4個(gè)縣、10個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)、13個(gè)村，共出現(xiàn)20個(gè)疫點(diǎn)，羊發(fā)病6122只，死亡1888只[4]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，2005年P(guān)PR可能就曾經(jīng)傳入與印度接壤的日土縣熱角村，但未被確診。PPR可能從印度傳入，在阿里境內(nèi)緩慢向東擴(kuò)散[3]。2008年西藏阿里地區(qū)革吉縣文布當(dāng)桑鄉(xiāng)羅瑪村發(fā)生野生巖羊小反芻獸疫疫情，未見家畜發(fā)病[5]。2008年6月初，在那曲地區(qū)尼瑪縣雙湖區(qū)嘎措鄉(xiāng)發(fā)生PPR疫情。2010年5月，阿里地區(qū)日土縣多瑪鄉(xiāng)烏江村斯亞點(diǎn)發(fā)生PPR疫情。我國(guó)西藏PPRV流行毒株屬于譜系4，與印度等國(guó)流行毒株遺傳進(jìn)化關(guān)系最近[3]。通過采取撲殺、大規(guī)模免疫、檢疫和移動(dòng)控制、野生動(dòng)物控制等綜合防控措施，上述疫情得到有效控制。此后，我國(guó)再無新的PPR疫情報(bào)道。

2013年11月27日，新疆伊犁州霍城縣發(fā)生不明山羊疫情。本研究經(jīng)臨床癥狀、剖檢變化、病原學(xué)和血清學(xué)診斷，確診該起疫情為小反芻獸疫病毒感染。這是我國(guó)新疆首次報(bào)道發(fā)生小反芻獸疫疫情。

1　材料和方法

1.1疫情概況

霍城縣獸醫(yī)站于2013年11月27日接到霍城縣三宮鄉(xiāng)獸醫(yī)站報(bào)告，霍城縣三宮鄉(xiāng)一村民飼養(yǎng)的2700只山羊，發(fā)病山羊1000余只，陸續(xù)死亡100多只。

1.2樣品采集

采集發(fā)病6只發(fā)病山羊的血清，采集8只發(fā)病山羊的口鼻棉拭子，解剖三只發(fā)病山羊，分別采集肺、肺門淋巴結(jié)、肺氣管、脾、腎、大腸、腸淋巴結(jié)、肝等組織，送中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心進(jìn)行檢測(cè)。

1.3實(shí)驗(yàn)室診斷

對(duì)于送檢樣品開展小反芻獸疫的檢測(cè)。對(duì)血清樣品用競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒（英國(guó)BDSL公司）檢測(cè)小反芻獸疫抗體。取適量組織樣品加PBS進(jìn)行研磨，制備組織勻漿液，將組織勻漿液和棉拭子樣品分別進(jìn)行小反芻獸疫抗原檢測(cè)和病毒核酸檢測(cè)?？乖瓩z測(cè)使用小反芻獸疫抗原捕獲ELISA試劑盒（英國(guó)BDSL公司）。

病毒核酸檢測(cè)使用兩種方法，分別為熒光定量RT—PCR[6]和基于N基因的RT—PCR[7]。對(duì)熒光定量RT—PCR和RT—PCR陽性的樣品分別進(jìn)行N基因片段和F基因片段的擴(kuò)增和序列測(cè)定。

1.4病毒分子特性分析

使用本中心數(shù)據(jù)庫和GenBank下載的小反芻獸疫病毒基因序列，分別針對(duì)N基因編碼序列的1253～1507 nt片段序列和F基因編碼序列的254～575 nt片段序列，使用MegAlign軟件進(jìn)行序列比對(duì)和相似性比較，使用MEGA4軟件進(jìn)行遺傳發(fā)生分析，構(gòu)建進(jìn)化樹。

2　結(jié)果

2.1現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查

霍城縣三宮鄉(xiāng)一村民飼養(yǎng)的2700只山羊，發(fā)病山羊1236只，陸續(xù)死亡203只。發(fā)病率為45.8%，病死率為16.4%。

2.2臨床癥狀

病山羊精神不振，呼吸困難，腹式呼吸，呼吸次數(shù)58次/分鐘，咳嗽，鼻腔和眼睛有膿性分泌物。體溫升高至38.8～40.1oC不等，腹瀉，有個(gè)別流產(chǎn)。（圖1）

圖1　發(fā)病山羊的臨床癥狀

2.3剖檢變化

共解剖四只山羊，剖解變化有，心臟增大、壁變薄。一側(cè)肺膠凍狀纖維素性物滲出，肺充血，肺、縱膈、心包粘連，氣管出血。肺門淋 巴結(jié)出血。肝腫大，呈土黃色，膽囊腫大。大腸粘膜充血，腸系膜淋巴結(jié)炎充血腫大，化膿。大腸粘膜出血、糜爛、有條紋狀出血。腎臟有出血點(diǎn)和水腫，脾臟無明顯變化。上消化道沒有明顯病變（圖2）。

圖2　發(fā)病山羊剖檢變化

2.4抗體檢測(cè)

六份發(fā)病山羊血清樣品經(jīng)小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)，都為PPRV特異性抗體強(qiáng)陽性。

2.5抗原檢測(cè)

三只病死山羊的組織樣品和8只發(fā)病山羊的口鼻棉拭子樣品，經(jīng)小反芻獸疫病毒抗原捕獲ELISA檢測(cè)，都為陽性。

2.6小反芻獸疫病毒熒光定量RT—PCR檢測(cè)

結(jié)果顯示，從三只病死山羊的組織樣品和8只發(fā)病山羊的口鼻棉拭子樣品中，都能檢測(cè)到特異性擴(kuò)增曲線，Ct值為20.51～33.47（見圖3）。

2.7小反芻獸疫病毒RT—PCR檢測(cè)

結(jié)果顯示，三只病死山羊的組織樣品和8只發(fā)病山羊的口鼻棉拭子樣品，在350 bp左右都有特異性擴(kuò)增條帶，與陽性對(duì)照一致（圖4）。

2.8N和F基因片段序列比較和遺傳發(fā)生分析

圖3　實(shí)時(shí)定量RT—PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4　病羊組織樣本RT—PCR檢測(cè)結(jié)果

針對(duì)2號(hào)樣本進(jìn)行PPRV N基因片段和F基因片段的擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，獲得長(zhǎng)度為255 bp的N基因片段序號(hào)和長(zhǎng)度為322 bp的F基因片段序列。與數(shù)據(jù)庫和GenBank下載的相應(yīng)序列進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示，N基因片段與小反芻獸疫病毒Nigeria 75/1疫苗株的同源性為87.5%，與西藏流行株的同源性為96.5%，與阿聯(lián)酋2009年Ibex株及巴基斯坦2012年流行毒株序列相似性為98.4%。F基因片段與小反芻獸疫病毒Nigeria 75/1疫苗株的同源性為92.7%，與西藏流行株的同源性為97.5%，與巴基斯坦2007年分離株序列相似性為99.7%，與Iran2010年流行株相似性為99.4%（表1）。

N基因片段序列的遺傳發(fā)生分析顯示，該毒株屬小反芻獸疫病毒譜系I V，與巴基斯坦2010及2012年流行毒株、塔吉克斯坦2004年流行毒株以及阿聯(lián)酋2009年Ibex株遺傳發(fā)生關(guān)系最近，與西藏2007年流行毒株分別屬于兩個(gè)小分支（圖5左）。F基因片段序列的遺傳發(fā)生分析表明，該樣本病毒屬于譜系IV，與與巴基斯坦2010年流行毒株、伊朗2010年流行毒株遺傳發(fā)生關(guān)系最近，同樣，與西藏2007年流行毒株分別屬于兩個(gè)小分支（圖5右）。

3　討論

2007年西藏首次發(fā)現(xiàn)小反芻獸疫，本實(shí)驗(yàn)室所做的毒株遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，其來源于印度流行株[8]，隨后，在流行病學(xué)調(diào)查中得到證明[9]。根據(jù)臨床癥狀和剖檢變化，通過抗體檢測(cè)、抗原檢測(cè)、病毒核酸檢測(cè)，對(duì)新疆首例小反芻獸疫疫情進(jìn)行確診，基因序列同源性分析以及遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，新疆PPRV毒株也屬于譜系4，但是為獨(dú)立于西藏流行株的一個(gè)新毒株。此次新疆PPRV毒株與巴基斯坦等國(guó)流行毒株遺傳關(guān)系較近，表明其由周邊國(guó)家傳入的可能性最大。

表1 小反芻獸疫病毒新疆毒株與周邊國(guó)家流行毒株部分基因序列同源性分析（%）

圖5　針對(duì)China/XJYL/2013 N基因編碼序列1253-1507nt片段序列（左圖）和F基因編碼序列254-575 nt片段序列（右圖）進(jìn)行遺傳發(fā)生分析

新疆陸地邊境線5600多公里，周邊與哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、塔吉克斯坦、巴基斯坦、蒙古、印度、阿富汗、俄羅斯等八個(gè)國(guó)家接壤。在這八個(gè)國(guó)家中，小反芻獸疫在印度、巴基斯坦、阿富汗等國(guó)呈地方性流行，而塔吉克斯塔和哈薩克斯坦也曾有PPR疫情報(bào)道。2013年9月，塔吉克斯塔向OIE報(bào)告發(fā)生PPR疫情。但是，新疆歷史上從來沒有PPR疫情報(bào)道。根據(jù)調(diào)查，發(fā)病羊群所在疫點(diǎn)為一新建的養(yǎng)殖小區(qū)，養(yǎng)殖戶從羊販處購得羊只用于育肥后出售。養(yǎng)殖密度大，而且冬季草料缺乏，羊只營(yíng)養(yǎng)狀況差，是發(fā)生疫情的誘因。目前，需要盡快開展疫情溯源。

[1] Banyard A C， S Parida， C Batten， et al. Global distribution of peste des petits ruminants virus and prospects for improved diagnosis and control [J]. J Gen Virol 2010，91：2885-2897.

[2] Dhar P， B P Sreenivasa， T Barrett， et al. Recent epidemiology of peste des petits ruminants virus （PPRV） [J]. Vet Microbiol，2002， 88：153-159.

[3] Wang Z， J Bao， X Wu， et al. Peste des petits ruminants virus in Tibet， China [J]. Emerg Infect Dis，2009，15：299-301.

[4] 王樂元， 次真， 吳國(guó)珍， 等. 中國(guó)西藏小反芻獸疫的發(fā)生狀況與防控 [J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42：717-720.

[5] Bao J， Z Wang， L Li， et al. Detection and genetic characterization of peste des petits ruminants virus in freeliving bharals （Pseudois nayaur） in Tibet， China [J]. Res Vet Sci，2011，90：238-240.

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[9] 陸則基， 王志亮， 劉雨田， 等. 西藏阿里地區(qū)小反芻獸疫流行病學(xué)調(diào)查研究 [J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2008，25（12）：44-47.

Diagnosis of Peste des Petits Ruminants in goats in Xinjiang China

Wang Qinghua1，Liu Chunju1，Wu Xiaodong1，Wang Hua1，Wang Mingguo2，Wang Yongsheng2，Tian Jianlong3，Sheng Zhuojun4，Lin Hanliang4，Ma Wei4，Li Lin1，Ren Weijie1，Wang Shujuan1，Zhao Wennian1，Bao Jingyue，Wang Zhiliang
（1. National Exotic Animal Disease research Center， China Animal Health and Epidemiology Center， Qingdao 266032； 2. Yili Region Animal Disease Control and Diagnosis Center， Yili， Xinjiang 835000； 3. Huocheng County Animal Husbandry and Veterinary Station， Yili， Xinjiang 835200； 4. Xinjiang Animal Disease Prevention and Control Center， Urumqi 830000）

An outbreak of Peste des Petits Ruminants-like disease in goats were reported in Huocheng county in Yili region of Xinjiang province. Clinical samples including tissue samples from 3 goats， oral swabs from 8 goats and sera from 6 goats were collected and sent to the laboratory. A number of diagnostic tests were used， including one step realtime RT—PCR， conventional RT—PCR， competitive ELISA and immunocapture ELISA. The presence of PPRV was detected in all the infected animals. Sequence analysis based on N and F gene partial sequence showed that the virus share a similarity of 96.5% （N） and 97.5% （F） with Tibet/07. Phylogenetic analysis showed that the virus fell into lineage 4， showing closely related to the virus from Pakistan.

Peste des Petits Ruminants；Peste des Petits Ruminants virus；Phylogenetic analysis

S851.3

：A

：1005-944X（2014）01-0072-04

農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫情監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)

王志亮，包靜月

注：劉春菊，吳曉東為貢獻(xiàn)相同作者