牛結核γ—干擾素ELISA檢測方法在檢疫工作中的應用

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（1.新疆兵團第八師獸醫(yī)站，新疆石河子832000；2.新疆兵團畜牧獸醫(yī)總站，新疆烏魯木齊830063；3.青島瑞爾生物技術有限公司，山東青島 266100；4.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266109）

牛結核γ—干擾素ELISA檢測方法在檢疫工作中的應用

周培校1，李 靜2，張魯安2，李 杰2，曹 瑞3，張喜悅4，李 巖2

（1.新疆兵團第八師獸醫(yī)站，新疆石河子832000；2.新疆兵團畜牧獸醫(yī)總站，新疆烏魯木齊830063；3.青島瑞爾生物技術有限公司，山東青島 266100；4.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266109）

為評價牛?—干擾素ELISA檢測方法檢測牛結核的效果及國產(chǎn)試劑盒的檢測效果，本試驗首先將國產(chǎn)試劑盒與Prionics試劑盒對42份相對陽性的樣品和105份相對陰性的樣品進行對比研究。然后對5個規(guī)?；龅?000頭奶牛首先進行國產(chǎn)單純結核菌素頸部皮內變態(tài)反應試驗，3天后選取皮內變態(tài)反應陽性和可疑及部分陰性牛共418頭，進行牛?—干擾素試驗。結果國產(chǎn)試劑盒對陽性和陰性樣品的檢測敏感性和特異性分別為95.2%和100%，與Priobics試劑盒的符合率為99.3%。表明國產(chǎn)試劑盒與進口試劑盒的檢測能力一致，牛?—干擾素檢測方法準確可靠。5個牛場的3000頭奶牛單純結核菌素頸部皮內變態(tài)反應試驗陽性為138頭，可疑105頭。?—干擾素試驗對418頭奶牛的檢測，其中陽性74頭，與頸部皮內變態(tài)反應（可疑牛暫時視為陰性）的符合率為60.5%。

牛結核；?—干擾素；ELISA；檢疫

牛結核是重要的人畜共患病，近年來，我國的牛結核疫情加重，嚴重威脅了畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康[1]。動物感染結核后，其免疫主要是細胞免疫，目前的檢測也主要是針對細胞免疫。結核菌素皮內變態(tài)反應試驗是我國的國標檢測方法，但實際應用表明該方法的敏感性和特異性均較低，而且需要兩次接觸動物，重復檢測需要間隔至少60天[2]。在此期間科學家們也在不斷尋求其他的檢測方法，1989年Wood[3]等描述了一種簡單的體外檢測方法，該方法檢測經(jīng)結核菌素（purif i ed protein derivative， PPD）刺激培養(yǎng)16-24小時的全血釋放的IFN—?，其基本原理是PPD遞呈到全血中的淋巴細胞后，感染牛分枝桿菌的細胞就能產(chǎn)生IFN—?，未感染的不會產(chǎn)生IFN—?。因此，IFN—?的檢測與牛結核的感染密切相關[4-5]。該方法用牛PPD和禽PPD分別刺激全血，敏感性和特異性都高于皮膚試驗[6-10]。Wood等[11]在澳大利亞的研究表明該方法的敏感性為95.2%特異性為96.3%。目前，此方法已被澳大利亞、新西蘭和歐美許多國家批準為正式試驗[12-13]。OIE將此方法列為皮內結核菌素試驗的替代試驗或平行試驗，兩者同時應用可提高敏感性，對牛結核的凈化意義重大。

近幾年，國內不斷引進與評價該方法在我國的應用，并自主研發(fā)試劑盒，其中青島瑞爾生物研發(fā)的牛結核?—干擾素ELSIA試劑盒完全按照理論原理進行研發(fā)[14]，制備并選取了兩株特異性的牛IFN—?單克隆抗體，該方法為雙單抗夾心法測定牛全血刺激上清中的牛IFN—?。ELSIA板包被牛IFN—?單克隆抗體，當加入全血刺激上清后進行孵育，洗滌后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的牛IFN—?單克隆抗體，孵育。洗滌后加TMB顯色。根據(jù)牛型PPD、禽型PPD和PBS刺激上清的對比，判定是否感染牛結核。此試劑盒操作步驟與進口試劑盒相比，操作更加簡單，也縮短了操作時間。

由于進口IFN—?檢測試劑盒價格昂貴，不利于在我國推廣使用，本研究的主要目的是對國內試劑盒進行對比評價并進行初步應用，為降低檢測成本，大力推廣?—干擾素試驗方法提供實驗依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑

國產(chǎn)牛結核?—干擾素ELISA試劑盒，購自青島瑞爾生物技術有限公司；進口牛結核?—干擾素試劑盒，瑞士Prionics公司；國產(chǎn)牛結核菌素，購自黑龍江生物制品一廠。

1.1.2臨床檢測動物

3000頭奶牛來自于新疆地區(qū)5個奶牛場，通過近幾年的檢測顯示5個牛場均有輕度牛結核病流行。

1.2方法

1.2.1陽性和陰性牛刺激上清的制備

無菌采集147頭奶牛的肝素抗凝血，每份全血分別用牛PPD、禽PPD和PBS刺激，37℃+5%CO2培養(yǎng)16-24小時，收集上清。其中12頭陽性牛剖檢檢查陽性，并分離出牛分枝桿菌（見表1），30頭皮內變態(tài)反應陽性牛來自于同一牛場，間隔60天重復檢測均為陽性，但未進行剖檢及分菌檢查，界定為相對陽性動物。105頭陰性牛為近三年檢測，皮內變態(tài)反應試驗結果均為陰性，但未進行剖檢及分菌檢查，因此未能確定為真陰性動物，視為相對陰性動物。

1.2.2刺激上清的ELISA試驗

將147份刺激上清分別用Prionics試劑盒與國產(chǎn)試劑盒同時檢測。操作步驟以國產(chǎn)試劑盒為例，每孔加入100μL待檢上清室溫孵育1h。洗滌，每孔加入100μL酶標抗體室溫孵育1小時。洗滌后每孔加入100μL底物溶液，室溫避光10min。加入終止液，測定OD450nm值。當牛PPD-禽PPD≥0.1且牛PPD-PBS≥0.1（OD值）時判為陽性，當牛PPD-禽PPD＜0.1或牛PPD-PBS＜0.1（OD值）時判為陰性。

1.2.2.1國產(chǎn)試劑盒的敏感性評價

對12份真陽性和30份皮內變態(tài)反應陽性牛刺激上清進行分析，評價試劑盒的診斷敏感性，敏感性=檢測陽性樣品數(shù)/總陽性樣品數(shù)。

1.2.2.2國產(chǎn)試劑盒的特異性評價

對105份近三年檢測陰性牛的樣品進行?—干擾素試驗，分析評價試劑盒的診斷特異性。特異性=檢測陰性樣品數(shù)/總陰性樣品數(shù)。

1.2.2.3與Prionics試劑盒的符合率

將國產(chǎn)試劑盒的檢測結果與Prionics試劑盒的結果進行對比分析，符合率=（試劑盒檢測陽性樣品為陽性的樣品數(shù)+ 試劑盒檢測陰性樣品為陰性的樣品數(shù)）/ 樣品總數(shù)。

1.2.3臨床檢測應用

對新疆地區(qū)5個奶牛場的3000頭奶牛進行檢測，首先用結核菌素皮內變態(tài)反應試驗進行檢測，3天后對皮內變態(tài)反應試驗陽性和可疑牛及部分陰性牛進行?—干擾素試驗。

1.2.3.1結核菌素皮內變態(tài)反應試驗

參照國標－動物結核病診斷技術（GB/T18645—2002）進行。陽性反應：局部有明顯的炎性反應，皮厚差大于或等于4mm。可疑反應：局部炎性反應不明顯； 皮厚差大于或等于2.0mm，小于4.0mm。陰性反應：無炎性反應；皮厚差在2.0mm以下。

1.2.3.2?—干擾素試驗

結核菌素皮內變態(tài)反應試驗后采集陽性、可疑和部分陰性牛的肝素抗凝全血，8小時之內運送至實驗室。全血用24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每份全血分別用牛PPD、禽PPD和PBS刺激37℃+5%CO2培養(yǎng)16～24小時，收集上清。上清用國產(chǎn)ELISA試劑盒進行檢測，陽性對照OD＞0.7且陰性對照OD＜0.15 時ELISA試驗成立

1.2.3.3數(shù)據(jù)分析

對結果進行對比分析。

2 結果

2.1敏感性試驗結果

12頭陽性牛剖檢大部分見特征性病理變化，肺部有黃豆大小的結核結節(jié)，結節(jié)剖檢可見米黃色干酪樣，淋巴結腫大，剖檢可見干酪樣病變等。其中2號牛與7號牛未見明顯病變。12頭牛組織分菌均為牛分枝桿菌，經(jīng)分型鑒定為同一SPOLIGOTYPING型[15]。國產(chǎn)試劑盒檢測結果為11頭陽性，1頭陰性，敏感性為91.7%，結果見表1。

表1 12頭陽性牛的皮膚試驗結果與?—干擾素結果

30份皮內變態(tài)反應陽性牛，?—干擾素檢測結果為陽性29頭，敏感性為96.7%。結合12頭陽性牛的結果，對42頭陽性牛的敏感性為95.2%。

2.2特異性試驗結果

對105份皮內變態(tài)反應陰性樣品進行檢測，?—干擾素結果均為陰性，特異性為100%。

2.3與Prionics試劑盒的符合率

對147份樣品進行國產(chǎn)試劑盒與Prionics試劑盒的對比分析，12份菌株分離陽性樣品的結果完全一致，30份皮內變態(tài)反應陽性牛的對比結果為Prionics陽性28，國產(chǎn)陽性29。Prionics結果陰性的2頭牛，其中1頭國產(chǎn)試劑盒結果也為陰性。兩頭牛的結果見表2。

表2 2頭皮膚試驗陽性牛的?—干擾素試驗對比結果

105頭皮內結核菌素試驗陰性牛，兩種試劑盒的?—干擾素試驗均為陰性，特異性為100%。通過實驗數(shù)據(jù)對比分析，兩個試劑盒的符合率為99.3%，結果見表3。

表3國產(chǎn)試劑盒與Prionics試劑盒的對比結果

2.4臨床檢測結果

對新疆地區(qū)5個奶牛場的3000頭奶牛進行檢測，首先用結核菌素皮內變態(tài)反應試驗進行檢測，對結果陽性、可疑牛及部分陰性牛進行?—干擾素試驗，結果對比如下。

3000頭奶牛，單純結核菌素頸部皮膚試驗陽性138頭，可疑105頭，陽性率為4.6%。

對皮內變態(tài)反應試驗的138頭陽性奶牛，105頭可疑奶牛和陰性的175頭奶牛共418頭進行?—干擾素試驗復檢。其中陽性74頭。若將禽型OD-牛型OD＞0且牛型OD值-PBS值≥0.1判為禽型感染，則禽陽性為27頭。皮內變態(tài)反應陽性牛有超過一半?—干擾素試驗檢測為陰性。其中皮內變態(tài)反應陰性和可疑牛中也有部分牛?—干擾素試驗檢測為陽性。若將皮膚試驗可疑牛視作陰性，則兩者的符合率為60.5%，結果見表4。

表4 ?—干擾素試驗與單純結核菌素頸部皮膚試驗結果的比較

3 討論

牛結核是一種慢性進行性傳染病，臨床癥狀不典型。在感染后期可出現(xiàn)包括體弱、厭食、消瘦、呼吸困難、淋巴結腫大和咳嗽等癥狀，可初步判斷。通過尸體剖檢，病理組織學檢查及細菌學技術可確診，但不能用于大規(guī)模的牛結核病的流行病學調查。皮內變態(tài)反應是普查牛結核使用最為廣泛的方法，該法價格低廉，但缺乏敏感性和特異性。?—干擾素方法是近20年來評價為最敏感，最特異的牛結核病診斷方法，已經(jīng)得到全世界的認可，在OIE手冊上也是作為皮內變態(tài)反應的替代或平行試驗[16]。

本研究首先對青島瑞爾生物技術有限公司研發(fā)的牛?—干擾素試劑盒與prionics的試劑盒進行了對比研究。對147份經(jīng)驗證或多次試驗證明為陽性或陰性的樣品進行檢測，國產(chǎn)試劑盒與prionics的試劑盒表現(xiàn)出了高度的一致性。對12份陽性樣品的檢測，結果11份陽性，對30份兩次變態(tài)反應均為陽性的樣品檢測，結果29份陽性，試劑盒的敏感性為95.2%。對105份連續(xù)3年檢測為陰性的牛全血刺激培養(yǎng)，結果均為陰性，相對特異性為100%。與瑞士Prionics試劑盒的符合率為99.3%。分析?—干擾素檢測陰性的陽性樣品，發(fā)現(xiàn)牛型和禽型PPD刺激的結果OD值均比較高，因此我們分析可能為混合感染，這與Amadori[13]的研究結果相似，遺憾的是我們并未分離非結核分枝桿菌。鑒于此種情況，我們可適當?shù)卣{整判定標準，當牛型和禽型OD值遠遠大于陰性對照，但牛型—禽型≤0.1時，可判定牛型＞禽型為陽性，或為混合感染?？傮w而言，國產(chǎn)試劑盒具有很高的敏感性，特異性，完全能夠滿足檢測的需求。

本研究中對皮膚試驗陽性的138頭奶牛，105頭可疑奶牛和陰性的175頭奶牛共418頭用?—干擾素試驗檢測，其中陽性74頭。若將禽型OD—牛型OD＞0且牛型OD值-PBS值≥0.1判為禽型感染，則禽陽性為27頭。皮內變態(tài)反應陽性牛有超過一半?—干擾素試驗檢測為陰性。其中皮內變態(tài)反應陰性和可疑牛中也有部分牛?—干擾素試驗檢測為陽性。不考慮皮膚試驗可疑的情況（視為陰性），?—干擾素禽陽性視為陰性，總體的?—干擾素陽性數(shù)量低于皮內變態(tài)反應試驗的陽性數(shù)量，這與張喜悅[17]之前的研究非常吻合，與wood的研究結果也是一致的。但在一些國家的研究中得出了相反的結果，?—干擾素的陽性率高于皮膚試驗（Neill等，Domingo等，O.R. Gonza?lez Llamazares等[18-19]）。這可能是由于感染流行情況不同造成的。

從檢測數(shù)據(jù)可以看出部分皮內變態(tài)陽性牛呈現(xiàn)出假陽性結果，這主要是由于皮內變態(tài)反應所應用的免疫學診斷試劑結核菌素純蛋白衍生物（PPD）是多種抗原的混合物，所含的抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及BCG所共有，由于交叉反應的存在，其非特異性的存在在所難免；若單獨用該方法檢出的PPD陽性牛既實行“檢疫—撲殺”策略，勢必誤殺部分假陽性牛；同時該法敏感性較低，而且與感染動物接觸的單位個體會出現(xiàn)假陽性反應，又因為在疫病早期階段和急性感染病例會發(fā)生假陰性反應，這樣又可能忽略部分感染牛。

IFN-?試驗的應用也受到一定的限制，該法基于結核分枝桿菌細胞免疫原理，需要活的淋巴細胞，必須在采血后8小時內培養(yǎng)，且需要有關的儀器設備并要求在實驗室內進行，對基層牛場的使用有所限制，所以通常將其作為皮內變態(tài)反應的輔助試驗，對皮內變態(tài)反應檢出的陽性和可疑的牛進行復檢。該法對皮內變態(tài)試驗后2—28天內進行檢測其敏感性和特異性不受影響，采樣后48h內即可出結果，對牛結核病的確診和流行病學調查提供了新的方法。此外，限制該法在國內推廣的另一主要原因在于其價格昂貴，國外試劑盒檢測單份樣品的價格高達120余元，對于我國大規(guī)模用于檢疫難以實現(xiàn)。因此，國產(chǎn)試劑盒的誕生在很大程度上彌補了這一缺陷。

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生豬屠宰監(jiān)督管理職責已全部劃入農(nóng)業(yè)部

中國獸醫(yī)信息網(wǎng) 近日，商務部與農(nóng)業(yè)部完成了生豬屠宰監(jiān)督管理職責移交工作。根據(jù)第十二屆全國人大一次會議表決通過的《國務院機構改革和職能轉變方案》（簡稱《方案》）和中央編辦有關文件，商務部的生豬屠宰監(jiān)督管理職責劃入農(nóng)業(yè)部，包括起草相關法律法規(guī)草案，制定配套規(guī)章、規(guī)范；制定行業(yè)發(fā)展規(guī)劃；負責行業(yè)統(tǒng)計；負責屠宰環(huán)節(jié)質量安全監(jiān)督管理，組織開展監(jiān)督檢查、技術鑒定等活動。近日，商務部與農(nóng)業(yè)部完成了生豬屠宰監(jiān)督管理職責移交工作。

農(nóng)業(yè)和食品安全方面的專家分析，生豬飼養(yǎng)、屠宰、肉品流通和質量監(jiān)管等分屬商務、衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、工商、食品、質量等多個部門管理，責任不清，執(zhí)行力分散，此次調整或有助于類似”八個部門管不好一頭豬”頑疾的解決。

The Application of Gamma Interferon ELISA in Bovine Tuberculosis Detection

Zhou Peixiao1， Li Jing2， Zhang Luan2， Li Jie2， Cao Rui3， Zhang Xiyue4， Li Yan2
（1.The 8 Division Vet station of Xinjiang Production and Construction Corps，Shi Hezi 832000； 2.Xinjiang Production and ConstructionCorps Animal Husbandry and Veterinary Station，Urumqi 830063； 3.Qingdao Real BIOTechnology Co.，Ltd， Qing Dao 266100； 4. China Animal Health and Epidemiology Center， Qing Dao 266109）

In order to evaluate the effectiveness of gamma interferon test to detect bovine tuberculosis and the detection effect of a domestic kit， a comparative study was done between Prionics kits and the domestic kits using 42 positive samples and 105 negative samples. Then 3000 cattle from fi ve intensive farms were fi rst tested with single skin test， and 3 days later， 418 cattle including skin test positive and suspicious ones and some negative ones were tested with gamma interferon test. Results showed that the sensitivity and specif i city of the domestic kit were 95.2% and 100% respectively. and the coincidence was 99.3% with the Prionics kit，suggesting that the gamma interferon test was accurate and reliable for detection of bovine tuberculosis， and the domestic kit was as good as the Prionics kit. There were 138 skin test positive cattle and 105 suspicious cattle from 3000 tested cattle. In gamma interferon test， 74 /418 cattle were detected positive， and the coincidence rate was 60.5% with skin test （suspicious cattle considered as negative）.

bovine tuberculosis；?—interferon；ELISA；quarantine inspection

S858.23文獻識別碼：B

：1005-944X（2014）01-0067-05

李巖