布魯氏菌實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)體系的建立及應(yīng)用

，，，

（1. 山西省陽(yáng)泉市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，山西陽(yáng)泉　045000；2. 山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西太原　030027； 3.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林長(zhǎng)春　130062 ）

布魯氏菌實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)體系的建立及應(yīng)用

石麗瑞1，李秀華1，韓惠瑛2，孟日增3

（1. 山西省陽(yáng)泉市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，山西陽(yáng)泉045000；2. 山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西太原030027； 3.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林長(zhǎng)春130062 ）

本根據(jù)GenBank上公布的布魯氏菌BCSP31基因保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物與TapMan探針，建立整套快速準(zhǔn)確鑒定布魯氏菌的實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)體系。以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的克隆有布魯氏菌目的片段的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)檢測(cè)，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品為模板，對(duì)該方法的特異性、敏感性與重復(fù)性進(jìn)行檢測(cè)與分析。并以臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，該檢測(cè)體系的檢測(cè)靈敏度高，重復(fù)性與特異性良好。本研究建立的實(shí)時(shí)定量熒光PCR可用于準(zhǔn)確檢測(cè)樣本中的少量的布魯氏菌，具有良好的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值。

布魯氏菌；實(shí)時(shí)定量熒光PCR； 樣本檢測(cè)

布魯氏菌?。ㄓ址Q馬耳他熱）是一種人畜共患傳染病，最早對(duì)于該病的報(bào)道源于19世紀(jì)[1-4]。布魯氏菌主要包括6個(gè)種屬 （羊、牛、豬、犬、綿羊和沙林鼠種布魯氏菌），其中，牛、羊、豬、犬種布魯氏菌為主要的人畜共患菌種[5]。感染該病的典型特征是生殖器官產(chǎn)生炎癥、流產(chǎn)、早產(chǎn)、不孕不育等一系列的生殖系統(tǒng)疾病[6-7]。由于布魯氏菌病隱性病例多，臨床上大多不具有明顯癥狀，往往造成對(duì)本病的忽視。此外，目前此病并無(wú)特效藥，對(duì)該病以防控為主，因此對(duì)該病的檢驗(yàn)檢測(cè)顯得尤為重要。目前，對(duì)該病菌（布魯氏菌）的主要檢測(cè)手段包括兩個(gè)方面：一是血清學(xué)檢測(cè)，包括沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等；二是分子生物學(xué)手段，包括DNA 探針和PCR檢測(cè)。前者適用于大規(guī)?？焖贆z測(cè)，后者適用于定性檢測(cè)。因此本研究致力于建立敏感、準(zhǔn)確的布氏桿菌實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料不同種屬的布魯氏菌菌種購(gòu)自中科院或由本單位保存；對(duì)照菌株等均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；疑似布魯氏菌病的血液或組織樣品由吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心協(xié)助采集；引物和探針由上海生工合成與制備；蛋白酶試劑均為Sigma公司產(chǎn)品；如無(wú)特殊說(shuō)明，其它相應(yīng)化學(xué)試劑（分析級(jí)）均購(gòu)自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1目的基因的確定、引物設(shè)計(jì)與合成

通過(guò)大量查閱文獻(xiàn)及資料，并在GenBank搜索相應(yīng)核酸序列，針對(duì)布魯氏菌基因序列，選取布魯氏菌膜外蛋白BSCP31基因的特異性保守區(qū)段設(shè)計(jì)特異性引物及探針：上游引物5'-GTTAATACCAAATATATCCCTGA-3’， 下 游引物5'-TCTGCGTCATAAAGCATTC-3’，探針FAM-TGCAGCCTCCACCGGGATGC-TAMRA，均配制成20 μmol/L，-20 ℃保存。設(shè)計(jì)好的引物及探針交由上海生工合成與制備。

1.2.2樣本DNA提取與制備

1.2.2.1材料處理取新鮮制備（通過(guò)培養(yǎng)布魯氏菌獲得）或冰凍臨床樣本（來(lái)自于疑似病例組織或血液）處理組織塊0.5～1.0cm3， 并用剪刀剪碎，然后加TE 1mL，并進(jìn)行勻漿。將勻漿液倒入到2mL離心管中。然后加入20% SDS 25 mL，蛋白酶K （2mg/mL） 25 mL進(jìn)行消化組織，60°C水浴2.5～3h。

1.2.2.2DNA提取按照常規(guī)方法進(jìn)行，大致過(guò)程如下： 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，混和、充分混勻3min， 5000g離心10min，取上層水相到另一1.5mL離心管中。加等體積飽和酚，混勻， 5000g離心10min，取上層水相到另一管中。加等體積酚/氯仿，輕輕混勻， 5000g離心10min，取上層水相到另一管中。加等體積氯仿，輕輕混勻，5000g離心10min，取上層水相到另一管中。加1/10體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕倒置混勻。待絮狀物出現(xiàn)后， 5000g離心5min，棄上清液。沉淀用75%乙醇洗滌， 5000g離心3min ，棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50～100mL TE溶解過(guò)夜。此外，在提取DNA的過(guò)程中我們也曾采用商品化的基因組DNA提取試劑盒抽提布魯氏菌全基因DNA，二者無(wú)明顯差異。

1.2.2.3模板DNA制備與提取選取引起布魯氏菌病的2株不同基因型的布魯氏菌懸液以10000r/m離心2min，棄上清，向沉淀中加入560μLTE緩沖液，反復(fù)吹打使之重懸，加入30μL的10% SDS和3μL蛋白酶K（20mg/mL），混勻，37℃孵育1h；加入100μL 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80μL CTAB/ NaCl溶液，混勻，65℃溫育10 min；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)入一新離心管中；加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀，10000 r/min離心15min，去上清；75%乙醇洗一次，去上清，干燥，加入50μL的TE緩沖液溶解DNA備用（如不能及時(shí)檢驗(yàn)，可將上清液于-20 ℃保存；-70 ℃可長(zhǎng)期保存）。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立為獲得最低Ct值、典型熒光擴(kuò)增曲線和較高熒光強(qiáng)度的引物和探針最佳濃度，測(cè)定提取細(xì)菌，選取40 ng/mL、60 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL、120ng/ mL 5組濃度；引物、探針濃度：1μM/0.5μM、5μM/2.5μM、10μM/5μM、20μM/10μM，用矩陣法篩選引物和探針的最佳使用量。選定60 ng/mL核酸濃度和10μM/5μM引物探針濃度。

1.2.3.125μL反應(yīng)體系TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL；上游引物（10μmol/L）1μL；下游引物（10μmol/L） 1μL；探針（5μmol/L） 1μL；DNA，5μL；ddH2O 4.5μL。

1.2.3.2反應(yīng)條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要設(shè)計(jì)兩個(gè)反應(yīng)階段：第一階段95℃ 15min；第二階段94℃ 10s、62℃45s，40個(gè)循環(huán)；熒光收集設(shè)置在62℃ 45s時(shí)進(jìn)行。

1.2.4特異性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)牛副結(jié)核分支桿菌、大腸桿菌、鏈球菌DNA，并設(shè)立ddH2O作為陰性對(duì)照，檢測(cè)引物和探針的特異性。

1.2.5敏感性與重復(fù)性試驗(yàn)

將核酸進(jìn)行10倍系列稀釋，用熒光定量PCR測(cè)定方法的敏感性。對(duì)同一陽(yáng)性樣品的4個(gè)不同稀釋度進(jìn)行3次重復(fù)熒光PCR檢測(cè)，通過(guò)組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)的熒光擴(kuò)增曲線及Ct值變化來(lái)評(píng)估方法的重復(fù)性。

1.2.6臨床樣本的檢測(cè)

從送檢的樣品中抽取30份進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證建立的熒光定量PCR方法的有效性。

2　結(jié)果

2.1反應(yīng)體系條件

為了建立良好的實(shí)時(shí)定量熒光PCR的反應(yīng)體系，并通過(guò)一系列條件的摸索與鑒定，確定了熒光定量PCR的檢測(cè)體系，結(jié)果如圖1所示。

圖1　反應(yīng)程序的確立

2.2特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證所建實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法的特異性，我們進(jìn)行了交叉檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明， 運(yùn)用本體系檢測(cè)牛副結(jié)核分支桿菌、大腸桿菌、鏈球菌DNA等結(jié)果均為陰性，只有布魯氏菌檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性（圖2），這表明，建立的實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法的表現(xiàn)出良好的特異性。

圖2　特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3重復(fù)性與敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證所建實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法的可靠性與重復(fù)性，進(jìn)行了多樣本多次檢測(cè)，結(jié)果表明，該方法檢測(cè)準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好。此外，該檢測(cè)體系也表現(xiàn)出了良好的敏感性，最低可檢測(cè)到的下限水平相當(dāng)于每微升2.0×101拷貝數(shù)的標(biāo)品（圖3、4）。

圖3　敏感性試驗(yàn)

圖4　重復(fù)性試驗(yàn)

2.4臨床樣品檢測(cè)

為證實(shí)所建熒光定量分析體系的準(zhǔn)確性，我們對(duì)采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與已知結(jié)果比較表明檢測(cè)符合率為100%。結(jié)果表明該方法特異性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性均較好，適合用于布魯氏菌檢測(cè)。

3　討論

布魯氏菌屬（Brucella）又稱布氏桿菌，屬于革蘭氏陰性的短小桿菌。該菌分為羊、牛、豬、鼠、綿羊及犬種布魯氏菌6個(gè)種，其中，羊、牛、豬等動(dòng)物最易感染該病，并容易引起流產(chǎn)等一系列嚴(yán)重后果[1-2，8-10]。人類也可以通過(guò)接觸帶病動(dòng)物產(chǎn)品等感染此病。布魯氏菌病在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。

我國(guó)部分地區(qū)曾有流行，特別是在50—60年代，現(xiàn)已基本控制。中國(guó)流行的主要是羊種、牛種和豬種三種布魯氏菌，其中以羊種布魯氏菌病分布最為廣泛。我國(guó)是該病的高發(fā)國(guó)家，特別是青海、新疆、內(nèi)蒙過(guò)及西藏等地。該病并無(wú)特效藥，有效的檢測(cè)和預(yù)防是防控本病的重中之重。因此，研究快速準(zhǔn)確并適合臨床檢測(cè)的技術(shù)尤為重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者也在這方面做了大量的努力，開發(fā)了大量的診斷本病的方法，主要包括以下幾個(gè)方面：（1）病原學(xué)檢測(cè)：本病的病原體的分離培養(yǎng)被認(rèn)為是本病的黃金標(biāo)準(zhǔn)。這種方法也被認(rèn)為診斷該病最為可靠的方法。但是這種方法，不僅費(fèi)時(shí)，而且危險(xiǎn)，因?yàn)樾枰囵B(yǎng)活菌[11-14]。因此，該方法不適合作為普遍的檢測(cè)方法；（2） 血清學(xué)檢測(cè)：該方法是診斷布魯氏菌的主要方法，有平板凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等[15-17]，但是血清學(xué)檢測(cè)特異性不強(qiáng)、敏感性差或操作煩瑣等缺點(diǎn)。近年來(lái)有很多分子生物學(xué)方法用于布魯氏菌檢測(cè)，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），該方法特異性強(qiáng)，敏感性高，并可以用于定性試驗(yàn)。1997年，Mari A等報(bào)道建立PCR快速診斷方法[3，18-29]，結(jié)果表明該方法特異性高。自此以后，一系列的研究報(bào)道使用PCR方法診斷與檢測(cè)布魯氏菌。但是，隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了熒光定量PCR技術(shù)。

在本研究中，我們根據(jù)布氏桿菌的保守基因設(shè)計(jì)引物并合成探針，并建立了熒光定量的分析體系，該檢測(cè)體系準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，并表現(xiàn)出了良好的檢測(cè)敏感性，這說(shuō)明該檢測(cè)體系具有良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。

[1] Alton G G， Jones L M， Angus R D， et al. Techniques for the brucellosis laboratory[M]. Paris， France： Institut National de la recherche Agronomique （INRA）， 1988.

[2] DelVecchio V G， Kapatral V， Redkar R J， et al. The genome sequence of the facultative intracellular pathogen Brucella melitensis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2002， 99（1）： 443-448.

[3] Baily G G， Krahn J B， Drasar B S， et al. Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplif i cation[J]. J Trop Med Hyg， 1992， 95（4）： 271-275.

[4] Verger J M， Grimont F， Grimont P A， et al. Brucella，a monospecific genus as shown by deoxyribonucleic acid hybridization[J]. Int J Syst Bacteriol， 1985， 35（3）： 292-295.

[5] Paulsen I T， Seshadri R， Nelson K E， et al. The Brucella suis genome reveals fundamental similarities between animal and plant pathogens and symbionts[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2002， 99（20）： 13148-13153.

[6] Colmenero J D， Reguera J M， Martos F， et al. Complications associated with Brucella melitensis infection： a study of 530 cases[J]. Medicine， 1996， 75（4）： 195-211.

[7] Schurig G G， Roop R M， Bagchi T， Boyle， et al. Biological properties of RB51； a stable rough strain of Brucella abortus[J]. Vet Microbiol， 1991，28（2）： 171-188.

[8] Memish Z， Mah M W， Mahmoud S A， et al. Brucella Bacteraemia： Clinical and Laboratory Observations in 160 Patients[J]. Journal of Infection， 2000， 40（1）： 59-63.

[9] Pizarro-Cerdá J， Méresse S， Parton R G， et al. Brucella abortus transits through the autophagic pathway and replicates in the endoplasmic reticulum of nonprofessional phagocytes[J]. Infection and Immunity， 1998， 66（12）： 5711-5724.

[10] Celli J， de Chastellier C， Franchini D M， et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum[J]. The Journal of Experimental Medicine， 2003， 198（4）： 545-556.

[11] Cheville N F， Stevens M G， Jensen A E， et al. Immune responses and protection against infection and abortion in cattle experimentally vaccinated with mutant strains of Brucella abortus[J]. Am J Vet Res， 1993， 54（10）： 1591-1597.

[12] Romero C， Gamazo C， Pardo M， et al. Specif i c detection of Brucella DNA by PCR[J] . J Clin microbiol， 1995， 33（3）： 615-617.

[13] Matar G M， Khneisser， I A， Abdelnoor A M. Rapid laboratory conf i rmation of human brucellosis by PCR analysis of a target sequence on the 31-kilodalton Brucella antigen DNA[J]. J Clin Microbiol， 1996， 34（2）： 477-478.

[14] Redkar R， Rose S， Bricker B， et al. Real-time detection of Brucella abortus， Brucella melitensis and Brucella suis[J]. Molecular and Cellular Probes， 2001， 15（1）： 43-52.

[15] Leal-Klevezas D S， Martínez-Vázquez I O， Lopez-Merino A， et al. Single-step PCR for detection of Brucella spp. from blood and milk of infected animals[J]. J Clin Microbiol， 1995，33（12）： 3087-3090.

[16] Halling S M， Peterson-Burch B D， Bricker B J， et al. Completion of the genome sequence of Brucella abortus and comparison to the highly similar genomes of Brucella melitensis and Brucella suis[J]. J Bacteriol， 2005， 187（8）： 2715-2726.

[17] Bricker B J， Halling S M. Differentiation of Brucella abortus bv. 1， 2， and 4， Brucella melitensis， Brucella ovis，and Brucella suis bv. 1 by PCR[J]. J Clin Microbiol， 1994， 32（11）： 2660-2666.

[18] Hong P C， Tsolis R M， Ficht T A. Identif i cation of genes required for chronic persistence of Brucella abortus in mice[J]. Infection and Immunity， 2000， 68（7）： 4102-4107.

[19] Sieira R， Comerci D J， Sánchez D O， et al. A Homologue of an Operon Required for DNA Transfer in Agrobacterium Is Required in Brucella abortus for Virulence and Intracellular Multiplication[J]. J Bacteriol， 2000， 182（17）： 4849-4855.

Establishment and application of real-time fl uorescence quantitative PCR system for the detection of Brucella spp

Shi Lirui1，Li Xiuhua1，Han Huiying2，Meng Rizeng3
（1.Yangquan City Agriculture Commission，Yangquan， Shanxi 045000；2.Shanxi Province Animal Disease Prevention and Control Center，Taiyuan， Shanxi 030027；3.Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changchun， Jilin 130062）

According to the conserved sequences of Brucella BCSP31 genes， a pair of specif i c primers and probe were designed and synthesized to establish a rapid and accurate detection system for identif i cation of Brucella by real-time quantitative PCR assay. The prepared Brucella recombinant plasmid containing target gene fragment was taken as the standard in the real-time quantitative fl uorescent PCR， and the standard curve was then established. The specif i city，sensitivity and reproducibility of this detection system were determined with standard as template. Comparison of clinical samples and standard samples showed that the PCR system was of high sensitivity， reproducibility and specif i city. In conclusion， the study established real-time quantitative fl uorescent PCR assay which could be used to detect small amount of Brucella in sample， with sound applicable prospect and quite good market value.

Brucella； real time fl uorescent quantitative PCR； sample detection

S852.614

：A

：1005-944X（2014）01-0057-04