γ—干擾素釋放法檢測奶牛結(jié)核病的比較試驗

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（1.無錫市動物園管理處，江蘇無錫 214000；2.無錫市動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇無錫 214021）

γ—干擾素釋放法檢測奶牛結(jié)核病的比較試驗

倪谷音1，毛愛民2，范 鋒2

（1.無錫市動物園管理處，江蘇無錫214000；2.無錫市動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇無錫214021）

目的評價?—干擾素釋放試驗（IGRA）牛結(jié)核病檢疫過程中的效果。方法在牛結(jié)核病檢疫過程中對皮試初篩為結(jié)核病和疑似結(jié)核病的89（74/15）頭奶牛同時進行r干擾素試驗、單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)（SCT）和比較皮試變態(tài)反應(yīng)（CCT）檢測，結(jié)果單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)二次檢疫中89頭牛均判為陽性，單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)與比較皮試變態(tài)反應(yīng)的陽性符合數(shù)為67頭。陽性符合率為75.3%；?—干擾素釋放試驗和單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)檢測兩者的陽性符合數(shù)為64頭，陽性符合率為71.9%；?—干擾素釋放試驗與比較皮試變態(tài)反應(yīng)的陽性符合數(shù)為58頭，陽性符合率為79.5 % 。陰性符合數(shù)為16頭，陰性符合率為48.4 % ；結(jié)論?—干擾素釋放試驗在保持較高靈敏度的同時，具有比變態(tài)反應(yīng)更好的特異性。

牛結(jié)核；?—干擾素試驗；單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)；比較皮試變態(tài)反應(yīng)

牛結(jié)核?。╞ovine tuberculosis）是由牛型分枝桿菌等所引起的一種人獸共患的慢性消耗性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為需通報的動物疫病。目前，我國主要采用牛型提純結(jié)核菌素（PPD）進行單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)（SCT）來進行牛結(jié)核病的檢疫，對于陽性牛應(yīng)進行隔離或撲殺，但是許多被撲殺的牛并沒有區(qū)分檢疫方法可能造成的假陽性，這對牛結(jié)核病的檢疫，奶牛業(yè)的發(fā)展造成了巨大的阻力。掌握我市奶牛結(jié)核病現(xiàn)狀、檢測淘汰感染奶牛意義重大，因此采用靈敏度更高、特異性更好的檢測方法具有廣泛應(yīng)用價值。為此，本研究旨在?—干擾素釋放試驗（IGRA）的應(yīng)用優(yōu)勢，通過比對單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)（SCT）、比較皮試變態(tài)反應(yīng)（CCT）和?—干擾素釋放試驗（IGRA）之間的效果，為臨床實際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1PPD與試劑盒 皮膚試驗用牛型PPD和禽型PPD購自中國獸醫(yī)監(jiān)察所；IGRA試劑盒購自瑞士Prionics公司。

1.2試驗用牛為我市春季奶牛兩病監(jiān)測中單純牛型PPD初篩為結(jié)核病陽性或疑似陽性的奶牛，計89頭，其中粗篩判為陽性的74頭，可疑的15頭。

1.3牛?—干擾素試驗?zāi)膛Ｎ察o脈無菌采血5mL／頭，將采集的血液置于肝素鈉抗凝管中，輕輕顛倒混勻，使肝素鈉溶解。室溫下將血樣運送到實驗室，在采血后8h內(nèi)進行刺激培養(yǎng)。將全血樣品無菌分裝至24孔板中，每份血樣分裝3孔，1.5ml／孔。向各孔中分別無菌加入100μL PBS、Avian PPD、Bovine PPD，震蕩混勻1min。將含有血液與抗原的24孔板置于37℃濕溫培養(yǎng)箱中孵育24h。次日從各培養(yǎng)孔吸取500μL血漿上清轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，即為刺激產(chǎn)生的?—干擾素上清。以Prionics公司購得的試劑盒檢測牛全血上清液中的?—干擾素，具體操作參照試劑盒說明書進行。結(jié)果判定標準：牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清的OD值—禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1判為陽性；牛型PPD刺激上清的OD值—PBS刺激上清的OD值＜0.1或牛型PPD刺激上清的OD值—禽型PPD刺激上清的OD值＜0.1判為陰性。

1.4單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)試驗參照國家標準《動物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB／T18645—2002）》進行，僅采用牛型PPD在奶牛頸部進行皮試變態(tài)反應(yīng)，劑量為2000國際單位（IU）/頭，分別于注射前和注射后72h測量皮膚厚度，并計算出皮厚差，依據(jù)國家標準判斷結(jié)果，對粗篩和二次復(fù)核均為可疑的判為陽性。

1.5比較變態(tài)反應(yīng)試驗參照OIE《動物疫苗和診斷手冊》中牛結(jié)核病診斷方法進行，該方法在歐盟（EU）國家廣泛使用，并以議會指令64/432/ EEC推薦。在牛頸部同時分點注射牛型和禽型PPD，使用劑量均為2000IU/頭，禽型PPD注射位點在牛型PPD下方間隔約10～15cm處。分別于注射前和注射后72h測量牛型PPD和禽型PPD注射處的皮膚厚度，并計算出各自的皮厚差。如果牛型PPD的皮厚差大于禽型PPD的皮厚差且超過4mm判為陽性，1～4mm為可疑，小于或等于禽型PPD的皮厚差為陰性。

2 結(jié)果

2.1SCT 、CCT、 IGRA 三種方法對89頭牛的檢疫結(jié)果為：SCT 檢出陽性89頭，檢出率（復(fù)核判定）100%，CCT檢出陽性67頭，檢出率（與SCT符合率）75.3%，IGRA檢出陽性64頭，檢出率（與SCT符合率）71.9%。

表1 SCT 、CCT、 IGRA三種牛結(jié)核病檢疫方法的比較

2.2CCT、 IGRA二種方法對檢出的陽性牛的結(jié)果差異為：共同檢出為陽性的58頭，陽性符合率79.5%，共同檢出陰性的16頭，陰性符合率48.4%，檢出結(jié)果有差異的15頭，其中CCT陽性而IGRA陰性的9頭，IGRA陽性而CCT陰性的6頭。

表2 CCT、 IGRA二種方法對檢出的陽性牛的結(jié)果比較

3 分析和討論

3.1牛結(jié)核活畜檢疫中的方法選擇 牛結(jié)核病的診斷方法主要有病原學(xué)診斷和免疫學(xué)診斷。病原學(xué)診斷包括傳統(tǒng)的細菌學(xué)檢測和分子生物學(xué)診斷技術(shù)。但目前分子生物學(xué)診斷技術(shù)（PCR診斷）敏感性較差，細菌學(xué)檢測則需要采集死亡家畜的病料來檢測，因此病原學(xué)診斷不適合大規(guī)模的活畜檢疫。牛結(jié)核病的免疫學(xué)檢測方法包括血清學(xué)檢測和細胞免疫檢測，一般認為分枝桿菌引起的機體免疫應(yīng)答以細胞免疫為主，因此檢測特異性抗體的EIISA方法應(yīng)用價值受限。目前在我國牛結(jié)核病檢疫過程中，主要采用SCT，但該方法存在較多的假陽性。另外，該方法具有操作過程困難、試驗所需時間較長、受外界干擾因素較多、結(jié)果判定主觀性較強等一系列缺陷。在本實驗過程中，我們將SCT 、CCT、IGRA進行了比較分析。結(jié)果顯示雖SCT具有較高的檢出率，但其特異性不好。

3.2目前在牛結(jié)核檢疫方法中最有應(yīng)用價值和前景的是抗原特異性牛?—干擾素試驗，其基本原理同結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，但整個操作過程在體外進行。牛型、禽型PPD同時刺激可以有效區(qū)分牛分枝桿菌感染和環(huán)境中的禽分枝桿菌的干擾。該方法克服了皮試變態(tài)反應(yīng)的技術(shù)性、主觀性以及環(huán)境分枝桿菌的干擾問題，同時還可以同其他疾病的檢測相結(jié)合，尤其是奶牛兩病普查時可以進行一次采血后可以同時進行牛結(jié)核病和布魯氏菌病的檢測，既節(jié)省了人力物力和時間，又可以減少對奶牛的刺激，防止造成產(chǎn)奶量的下降。

3.3IGRA已被OIE認可，可作為牛結(jié)核病的輔助確診試驗，并在歐盟、美國、澳大利亞和新西蘭被批準為正式試驗。以IGRA作為結(jié)果判定標準，可排除25頭牛感染牛結(jié)核病，削減損失。實驗結(jié)果顯示，SCT雖具有較好的敏感性，陽性檢出率明顯高于IGRA，但與IGRA相比。特異性較低，可能的主要原因之一是SCT檢出的陽性牛中，有相當一部分是由禽結(jié)核感染照成的干擾，通過CCT法也可證實這一特點。IGRA法敏感性和特異性與OIE《動物疫苗和診斷手冊》在歐盟（EU）國家廣泛使用CCT法對比，本實驗顯示者的差異性不大，可推薦使用，且前者保持較高靈敏度的同時，具有后者更好的特異性。

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農(nóng)業(yè)部副部長于康震要求加強畜禽屠宰行業(yè)管理 保障畜禽產(chǎn)品安全

農(nóng)業(yè)新聞網(wǎng) 12月20日上午，農(nóng)業(yè)部召開全國畜禽屠宰行業(yè)管理視頻會議，認真學(xué)習(xí)貫徹中央經(jīng)濟工作會議及國務(wù)院機構(gòu)改革和職能轉(zhuǎn)變精神，研究落實畜禽屠宰監(jiān)管職責(zé)調(diào)整，加強畜禽屠宰行業(yè)管理，確保畜禽產(chǎn)品安全。農(nóng)業(yè)部副部長于康震強調(diào)，要充分認識做好畜禽產(chǎn)品安全監(jiān)管工作的重要意義，切實增強責(zé)任感、使命感和緊迫感，認真梳理畜禽產(chǎn)品安全監(jiān)管工作主要任務(wù)，以改革的精神、創(chuàng)新的方法、強有力的措施做好畜禽產(chǎn)品安全監(jiān)管工作。

A Comparative Study of γ—Interferon Release Assay in Bovine Tuberculosis

Ni Guyin1，Mao Aimin2，F(xiàn)an Feng2
（1.Wuxi Zoo Management Off i ce， Wuxi， Jiangsu 214000；2. Wuxi Center for Animal Disease Prevention And Control， Wuxi， Jiangsu 214021）

ObjectiveTo evaluate the effect of ?—interferon release assay （IGRA） in bovine tuberculosis detection.Method89（74 positive/15 suspicious） dairy cows preliminarily screened with skin test were tested by?—inerferon release assay （IGRA）， simple cervical allergy skin test （SCT） and comparative allergy cervical test （CCT）.Result89 cows were considered as bovine tuberculosis positive in SCT， and 67 of them were considered as positive in CCT with the positive coincidence of 75.3%. 64 cows were considered as positive both in IGRA and SCT with the positive coincidence of 71.9%. 58 cows were considered as positive both in IGRA and CCT， with the positive coincidence of 79.5%. 16 cows were considered as negative， with the negative coincidence of 48.4%.ConclusionThe ?—interferon release was of higher sensitivity and better specif i city than the other two allergy tests.

bovine tuberculosis； ?—interferon release assay； simple cervical allergy skin test； comparative allergy skin test

S852.618；S855.2

：B

：1005-944X（2014）01-0064-03

江蘇省2012農(nóng)業(yè)三新工程《奶牛布病，結(jié)核病防治集成技術(shù)的推廣應(yīng)用》項目資助，SXGC[2012]032