生物轉(zhuǎn)化法制備白頭翁皂苷A3

曹 體 爽，劉 廷 強(qiáng)，王 東 明，金 鳳 燮，魚 紅 閃

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

白頭翁皂苷是中藥白頭翁重要的活性成分之一，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在8～10%。其中天然存在的大部分都是多糖基的皂苷，分子質(zhì)量大，不易于人體吸收利用［1］。白頭翁皂苷A3［2］是具有2個糖基的低糖基皂苷，有研究表明，白頭翁皂苷A3可保護(hù)由于氰化鈉及葡萄糖缺乏造成的細(xì)胞模型PC－12，減少細(xì)胞凋亡。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測得濃度分別為0.1、1、10mg／mL的白頭翁皂苷A3均可以對細(xì)胞起到保護(hù)作用［3］。本實(shí)驗室前期在白頭翁皂苷的分離提?。?］、生物轉(zhuǎn)化及其分離純化［5］方面做了大量工作，發(fā)現(xiàn)了白頭翁皂苷的提取方法以及對白頭翁皂苷具有水解作用的酶。

本實(shí)驗利用生物轉(zhuǎn)化法，以白頭翁總皂苷為底物，制備低糖基皂苷A3，并通過硅膠柱層析及結(jié)晶與重結(jié)晶等方法對產(chǎn)物白頭翁皂苷A3進(jìn)行精制，為制備高純度的白頭翁皂苷A3提供依據(jù)。

1 實(shí) 驗

1.1 材料與儀器

中藥白頭翁，購于大連同仁堂藥店，產(chǎn)地東北；白頭翁A3標(biāo)準(zhǔn)品，廣州暨南大學(xué)葉文才教授提供。菌種Absidiasp.P00r，由大連工業(yè)大學(xué)生物學(xué)院菌種保藏所提供；薄層層析板Silica Gel 60－F254；硅膠柱；Waters 2695高效液相色譜分析儀。

1.2 方 法

1.2.1 白頭翁總皂苷的制備

根據(jù)文獻(xiàn)［4］所述方法制備白頭翁總皂苷。

1.2.2 酶液的制備

根據(jù)文獻(xiàn)［6］所述方法制備酶液。

1.2.3 白頭翁皂苷的生物轉(zhuǎn)化

白頭翁總皂苷用20mol／L pH 5.0的HAc－NaAc緩沖液配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的酶反應(yīng)底物，加入等體積酶液，40 ℃條件下于5L 反應(yīng)釜中反應(yīng)24h。反應(yīng)液經(jīng)AB－8脫糖、D－296脫色處理后濃縮蒸干，即得白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物。

1.2.4 硅膠層析分離白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物

取制得的白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物，以3倍樣品質(zhì)量的80～100目硅膠制成樣品膠，15倍樣品質(zhì)量的300～400目硅膠做分離膠。用一定量的純氯仿通柱，按照V（氯仿）∶V（甲醇）＝9.5∶0.5、9∶1、8.8∶1.2、8.5∶1.5 依次進(jìn)行洗脫。每200mL收集一瓶，并用TLC法跟蹤檢測。

1.2.5 結(jié)晶法純化白頭翁皂苷A3

將硅膠柱分離得到的含白頭翁皂苷A3的組分溶于甲醇中，室溫放置，自然揮發(fā)結(jié)晶，得到針狀晶體。過濾收集針狀物，再將針狀晶體用甲醇加熱溶解、過濾，不溶物單獨(dú)收集，濾液放置室溫下?lián)]發(fā)重結(jié)晶，24h 后有針狀晶體析出，積累到一定程度時，過濾收集晶體。

1.2.6 HPLC法檢測白頭翁皂苷A3的純度

檢測器為Waters 2996二極管陣列檢測器，Empower 色譜工作站進(jìn)行檢測。色譜柱為Kromasil C18柱（5μm，φ4.6mm×200mm）；進(jìn)樣量，10μL；柱溫，35 ℃；體積流量，1.0mL／min；檢測波長，205nm。

流動相：乙腈（A）－水（B）；0～10min，φ（A）＝20%～28%；10～20 min，φ（A）＝28%；20～25min，φ（A）＝28%～32%；25～40min，φ（A）＝32%～40%；40～50min，φ（A）＝40%～100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 白頭翁總皂苷的制備及其生物轉(zhuǎn)化

中藥白頭翁1 000g經(jīng)70%酒精浸泡3次，浸提液合并濃縮，再經(jīng)脫脂、脫糖、脫色后，蒸干洗脫液共得白頭翁總皂苷98.6g，得率為9.86%。取白頭翁總皂苷50.0g，經(jīng)Absidiasp.P00r產(chǎn)的粗酶液轉(zhuǎn)化后，經(jīng)脫糖、脫色處理，得到產(chǎn)物總皂苷34.2g，得率為68.4%。TLC法檢測酶水解白頭翁總皂苷結(jié)果如圖1所示。

圖1 TLC檢測白頭翁總皂苷的生物轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.1 Result of biotransformation of total pulsatilla saponins

2.2 硅膠柱層析法分離白頭翁皂苷A3

利用硅膠柱層析法分離白頭翁皂苷A3，根據(jù)TLC檢測結(jié)果，分別收集較純的各組分，收集情況如表1所示。

表1 白頭翁總皂苷A3洗脫分離收集表Tab.1 Fractions of anemoside A3eluted from silica gel

經(jīng)硅膠柱層析法分別獲得了較純的3種組分。由圖2可以看出，3種組分在TLC板中均為單點(diǎn)，與標(biāo)準(zhǔn)品作對照，組分3為白頭翁總皂苷A3。

圖2 白頭翁總皂苷A3單點(diǎn)組分TLC圖Fig.2 TLC result of anemoside A3pure fractions

采用HPLC 法檢測組分3 中白頭翁總皂苷A3的純度，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，雖然組分3在TLC 上呈現(xiàn)單點(diǎn)，但是在HPLC圖譜中顯示出2 個吸收峰。其中出峰時間為45.384min與標(biāo)準(zhǔn)品白頭翁皂苷A3的出峰時間相近，說明組分3中不僅含有白頭翁皂苷A3，還含有一種與白頭翁皂苷A3極性相近的物質(zhì)。因此，需要對A3進(jìn)行進(jìn)一步精制。

圖3 HPLC法檢測組分3中白頭翁總皂苷A3的純度Fig.3 HPLC result of standard of anemoside A3 and fraction 3

2.3 結(jié)晶法純化白頭翁皂苷A3

甲醇溶解硅膠柱分離得到的組分3，靜置結(jié)晶，得到無色針狀晶體。晶體經(jīng)HPLC 檢測，第一次結(jié)晶并未將組分3 中的2 種物質(zhì)分開。因此，再用甲醇將第一次結(jié)晶得到的樣品進(jìn)行溶解，溶解過程中，發(fā)現(xiàn)有一部分白色沉淀物質(zhì)并不溶解。將不溶于甲醇的部分單獨(dú)收集、干燥，對不溶物進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如圖4所示。

圖4 組分3再次結(jié)晶產(chǎn)物的HPLC檢測結(jié)果Fig.4 HPLC result of fraction 3recrystallization

與圖3（a）對照可以看出，第二次甲醇溶解時，不溶解部分為白頭翁皂苷A3（圖4），質(zhì)量為1.56g，得率為30.59%，純度達(dá)到95.4%以上。硅膠柱分離得到的組分3，第一次甲醇完全溶解。而再結(jié)晶獲得的晶體物質(zhì)再用甲醇進(jìn)行溶解時，大部分并未溶解，從而分離得到了白頭翁皂苷A3。這可能是由于組分3中含有其他雜質(zhì)，第一次結(jié)晶時，對白頭翁皂苷A3起到了助溶的作用；同時說明組分3中另一種成分在甲醇中的溶解性更好。

3 結(jié) 論

50g白頭翁總皂苷經(jīng)生物轉(zhuǎn)化，并經(jīng)AB－8、D－296脫糖、脫色，可得酶解產(chǎn)物34.2g，得率為68.4%。采用硅膠柱層析法分離純化白頭翁皂苷A3，以V（氯仿）∶V（甲醇）＝9∶1的洗脫劑洗脫出含白頭翁皂苷A3及與其極性相近的物質(zhì)的混合物，得率為15%。經(jīng)結(jié)晶法可以制得純度為95.4%白頭翁皂苷A3，得率為4.56%，達(dá)到了對白頭翁皂苷A3分離純化的目的。

本實(shí)驗以白頭翁總皂苷為底物，利用生物轉(zhuǎn)化法成功制備出純度較高的低糖基白頭翁皂苷A3。

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