微小RNA與甲狀腺癌的關(guān)系及其研究進(jìn)展

戴文斌

廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院病理科，廣西柳州 545006

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌腺惡性腫瘤，占癌癥發(fā)病率的2.59%，包括甲狀腺乳頭狀癌（PTC），甲狀腺濾泡癌（FTC）、甲狀腺未分化癌（ATC）和甲狀腺髓樣癌（MTC），前三者起源于濾泡上皮細(xì)胞，后者起源于濾泡旁細(xì)胞，其中PTC約占甲狀腺癌的80%。目前，甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，通過(guò)對(duì)甲狀腺癌病因及發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究，對(duì)于提高其診斷率、指導(dǎo)治療及改善預(yù)后具有重要的臨床意義。miRNA是一類(lèi)廣泛存在于真核細(xì)胞中的長(zhǎng)約22 nt的單鏈、非蛋白編碼RNA，能對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、增殖、代謝和凋亡等基本的生理過(guò)程。近年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文就miRNA與甲狀腺癌相關(guān)的研究進(jìn)展做一綜述。

1 miRNA的生物合成及作用機(jī)制

1.1 miRNA的生物合成

miRNA由不同的染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而成，定位于獨(dú)立的非編碼RNA或蛋白編碼基因的內(nèi)顯子。miRNA生物合成和成熟過(guò)程如下：miRNA基因在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ的參與下轉(zhuǎn)錄生成初始 miRNA（pri-miRNA），后者在細(xì)胞核中被RNA酶Ⅲ Drosha-DGCR復(fù)合體切割，形成60～70個(gè)nt的 5′端含有磷酸基，3′端有二核苷酸突出的發(fā)夾狀前體 miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA在 RAN.GTP依賴(lài)的外運(yùn)蛋白-5（exportin-5）的轉(zhuǎn)運(yùn)下輸送到胞質(zhì)中。最后，酶Dicer將pre-miRNA切割成約 20 bp的雙鏈RNA，后經(jīng)解旋酶的作用，產(chǎn)生兩條成熟的單鏈 miRNA，其中5′末端自由能較低的一條單鏈miRNA被整合到miRNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（miRNA-induced silencing complexes，miRISC）中，形成非對(duì)稱(chēng) RISC復(fù)合物（asymmetric RISC assembly），作為成熟的miRNA發(fā)揮作用，而另一條鏈降解[1]。

1.2 miRNA的作用機(jī)制

miRNA是通過(guò)與靶基因的結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后翻譯的抑制而發(fā)揮作用。主要通過(guò)以下三種作用模式與靶基因結(jié)合[2]：第一種作用時(shí)與靶基因 mRNA3′-UTR進(jìn)行不完全的堿基配對(duì)，形成多個(gè)不完全結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄后翻譯的抑制，抑制蛋白的合成，這種方式目前發(fā)現(xiàn)最多，如lin-4。第二種以miR-171為代表，作用時(shí)與靶基因mRNA形成完全或近似完全配對(duì)，通過(guò)RNAi的機(jī)制降解mRNA。第三種以let-7為代表，它具有以上兩種作用模式，當(dāng)與靶基因完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，通過(guò)RNAi的機(jī)制降解mRNA，當(dāng)與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，抑制蛋白的合成，負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。迄今為止，人類(lèi)基因組可能存有1000多種miRNA基因，目前已被證實(shí)的miRNA有700多個(gè)，一個(gè)miRNA可作用于多個(gè)靶基因，甚至能同時(shí)調(diào)節(jié)上百個(gè)基因，發(fā)揮巨大的調(diào)控功能。

2 miRNA與腫瘤的關(guān)系

近年來(lái)，miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）與腫瘤形成的相關(guān)性已成為關(guān)注的熱點(diǎn)。主要表現(xiàn)在：首先miRNA參與了細(xì)胞分化、增殖、代謝、凋亡、細(xì)胞周期等過(guò)程；其次miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在，超過(guò)一半的miRNA位于或靠近腫瘤相關(guān)基因組的區(qū)域和脆性位點(diǎn)、雜合型丟失區(qū)、擴(kuò)增區(qū)或斷裂點(diǎn)區(qū)，即經(jīng)常發(fā)生缺失、擴(kuò)增、易位的染色體片段。再次miRNA在多種腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)；最后miRNA前體上的突變或多態(tài)影響miRNA的加工成熟和癌的易感性，這些都提示miRNA與腫瘤密切相關(guān)[3]。miRNA廣泛參與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展等生命過(guò)程，與乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌及前列腺癌等[4-9]多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

3 miRNA與甲狀腺癌的關(guān)系

近年來(lái)，眾多學(xué)者研究認(rèn)為多種miRNA與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有重要關(guān)系[10]。這些異常表達(dá)的miRNA有的發(fā)揮癌基因的作用，有的發(fā)揮抑癌基因的作用，還有的則會(huì)影響甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移等。

3.1 miRNA及其調(diào)控靶基因在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用

Vriens等[11]對(duì)104例甲狀腺組織的miRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，miR-100、miR-125b、miR-138、miR-768-3p 在PTC、FTC、ATC等惡性腫瘤呈高表達(dá)，在良惡性腫瘤中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這四種miRNA可能與甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Keutgen等[12]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)術(shù)后29例難診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的細(xì)針穿刺（FNA）組織中六種 miRNA（miR-222、miR-181a、miR-146b、miR-328、miR-197、miR-21）的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn) ，miR-222、miR-21、miR-181a、miR-146b在良惡性結(jié)節(jié)中的表達(dá)差異顯著，提示這四種miRNA可能與甲狀腺癌的發(fā)生有關(guān)，并可作為難診斷的FNA組織的輔助鑒別方法。Pallante等[13]在分析PTC的miRNA表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)有6種miRNA相對(duì)正常甲狀腺組織有較高的水平， 分別為 miR-221、miR-222、miR-213、miR-220、miR-181b、miR-146，其中在所有腫瘤樣品中均增高的有miR-221、miR-222和miR-181b。Kit是細(xì)胞分化和生長(zhǎng)中重要的酪氨酸激酶受體，研究發(fā)現(xiàn)，PTC組織或細(xì)胞系中miR-221、miR-222和 miR-146過(guò)度表達(dá)，而 Kit蛋白表達(dá)顯著下降或無(wú)法檢出，可能的原因是與前三者結(jié)合的Kit的3′-UTR端結(jié)合區(qū)域關(guān)鍵部位出現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性，從而導(dǎo)致Kit轉(zhuǎn)錄下降，蛋白水平低下，是其靶基因，證實(shí)了miR-221、miR-222、miR-181b表達(dá)上調(diào)是人類(lèi) PTC的特征性表現(xiàn)，同時(shí)可通過(guò)分析甲狀腺組織中這些miRNA的表達(dá)水平來(lái)鑒別其良惡性。Visone等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-221和miR-222在PTC中呈高表達(dá)，而p27kip1蛋白水平下調(diào)，miR-222和 miR-221可能通過(guò)與 p27kip1mRNA3′-UTR中的 1262-1269、1336-1342和 1660-1667三個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)p27kip1基因的負(fù)調(diào)控來(lái)誘導(dǎo)PTC的發(fā)生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)無(wú)論是轉(zhuǎn)染miR-221和miR-222還是它們各自的抑制物，都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)p27kip1mRNA水平的明顯改變，結(jié)果表明miR-221和miR-222可能是通過(guò)抑制p27kip1mRNA的翻譯而不是通過(guò)降解p27kip1mRNA來(lái)調(diào)控p27kip1蛋白的表達(dá)。Yip等[15]在比較17例有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的PTC和15例無(wú)擴(kuò)散的PTC中miRNA的表達(dá)情況中發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組中miR-146b、miR-222 高表達(dá)和 miR-1、miR-34b、miR-130b 低表達(dá)，兩組比較差異有顯著性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-1、miR-34b低表達(dá)導(dǎo)致MET基因蛋白高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲性相關(guān)，MET可能為 miR-1、miR-34b的靶基因。Dorris等[16]在111例甲狀腺標(biāo)本中研究發(fā)現(xiàn)，橋本甲狀腺炎與PTC相比，miR-141表達(dá)明顯下調(diào)，miR-141可能成為區(qū)分橋本甲狀腺炎與PTC的一個(gè)重要標(biāo)志物。Yu等[17]分析106例 PTC、95例甲狀腺良性結(jié)節(jié)和44例健康志愿者血漿中的miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-let-7e、miR-151-5p、miR-222 在 PTC 患者血漿中的表達(dá)明顯高于良性結(jié)節(jié)及健康志愿者，這三種miRNA的診斷敏感性及特異性較高，且miRNA的高表達(dá)還與癌組織的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織浸潤(rùn)等腫瘤TNM分期直接相關(guān)，術(shù)后miR-151-5p、miR-222表達(dá)明顯下降。

Weber等[18]比較FTC和腺瘤中miRNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn) miR-192、miR-197、miR-328和 miR-346在癌組織中水平升高。將miR-197和miR-346的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染到細(xì)胞株FTC133和K5，與無(wú)轉(zhuǎn)染的對(duì)照相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制有顯著差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-197和miR-346高表達(dá)的FTC組織中靶基因 ACVR1、TSPAN3和 EFEMP2表達(dá)降低，其中EFEMP2作為miR-346的靶基因，是一種抑癌因子，主要起穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)作用，而ACVR1和TSPAN3為miR-197的兩個(gè)靶基因，其中ACVR1作為激活素A配體和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的受體，具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，三者的異常表達(dá)共同促進(jìn)甲狀腺癌的增殖和侵襲能力，認(rèn)為miR-197和miR-346與FTC的發(fā)生有關(guān)，并在其中充當(dāng)癌基因。Nikiforova等[19]在FTC的研究中發(fā)現(xiàn)上調(diào)最多的miRNA 有 miR-187、miR-224、miR-155、miR-222 與 miR-221，在增生性結(jié)節(jié)中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)miRNA上調(diào)。此外，Colamaio等[20]發(fā)現(xiàn)miR-191在FTC中的表達(dá)明顯下調(diào)，可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)CDK6，抑制細(xì)胞周期使細(xì)胞阻滯在G1期而抑制了細(xì)胞增殖。

Visone 等[14]在研究人 ATC 中發(fā)現(xiàn)，miR-30d、miR-125b、miR-26a和miR-30a-5p顯著性減少，并進(jìn)一步通過(guò)Northern Blot、RT-PCR分析發(fā)現(xiàn) miR-125b和 miR-26a的下調(diào)作用在誘導(dǎo)癌變起了關(guān)鍵作用，相反，miR-30d和miR-30a-5p則是上調(diào)機(jī)制而誘發(fā)癌變，且通過(guò)上調(diào)ATC細(xì)胞中miR-125b和miR-26a的表達(dá)，成功地促進(jìn)HMGAI和HMGA2基因表達(dá)，從而減少細(xì)胞的增生，認(rèn)為HMGAI和HMGA2可能為miR-125b和 miR-26a的靶基因。Braun等[21]發(fā)現(xiàn)在A(yíng)TC中miRNA-200和miRNA-30表達(dá)顯著降低，并且這些miRNA表達(dá)失常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)ATC的侵襲能力，從而為今后ATC的治療提供有效的分子基礎(chǔ)。Takakura等[22]利用miRNA芯片分析和Northern Blot技術(shù)證實(shí)了miR-l7-92簇在人ATCARO和FRO細(xì)胞系過(guò)度表達(dá)，為了研究這些miRNA在A(yíng)TC中的功能，他們將其抑制因子miRNA轉(zhuǎn)染到ARO和FRO細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)miR-17-3p導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)完全受抑制，并推測(cè)是半胱天冬酶激活引起凋亡，而抑制 miR-17-5p和miR-19a的表達(dá)可以使視網(wǎng)膜母細(xì)胞基因 1（RB1）和 PTEN蛋白表達(dá)增加，從而抑制細(xì)胞增生和促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡，后二者可能為其靶基因。研究認(rèn)為，miR-17-92簇對(duì)人ATC具有重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)這些研究為ATC的基因治療提供了新的思路。

有關(guān)miRNA與甲狀腺髓樣癌（MTC）的研究較少，目前普遍認(rèn)為MTC是由RET原癌基因突變引起。Abraham等[23]在比較家族性髓樣癌（HMTC）及散發(fā)性髓樣癌（SMTC）miRNA表達(dá)的差異發(fā)現(xiàn)，SMTC中miR-183和miR-375高表達(dá)，而miR-9低表達(dá)，并且 miR-183、miR-375與髓樣癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)。Mian等[24]將MTC與正常甲狀腺組織進(jìn)行miRNA芯片比較，發(fā)現(xiàn)miR-9、miR-21、miR-127、miR-154、miR-183、miR-224、miR-323、miR-370、miR-375在MTC組織中明顯上調(diào)，其中 miR-127與RET基因突變明顯相關(guān)。

3.2 miRNA與甲狀腺癌相關(guān)體細(xì)胞基因改變

甲狀腺癌發(fā)生包含了一系列高發(fā)的遺傳事件，如PTC的發(fā)生與染色體重組致癌基因融合（RET/PTC1、RET/PTC3），RAS、BRAF基因突變等有關(guān)[25]，而FTC主要與PAX8/PPAR融合基因、RAS基因突變有關(guān)[26]。 RET、BRAF、RAS基因改變均與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)傳導(dǎo)通路中激酶的激活有關(guān)，而MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活與腫瘤的形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌相關(guān)體細(xì)胞基因改變與miRNA的異常表達(dá)有關(guān)。Huang等[27]在研究69例PTC及其周?chē)＜谞钕俳M織中發(fā)現(xiàn)，BRAF（V600E）的突變率為47.8%，并發(fā)現(xiàn)12種miRNA表達(dá)上調(diào)，6種表達(dá)下調(diào)，其中BRAF基因突變導(dǎo)致miR-21和miR-203的表達(dá)失調(diào)，BRAF突變和miR-21過(guò)表達(dá)與PTC高侵襲性和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Yip等[15]在PTC的研究中發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)與突變或重排位點(diǎn)（BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8-PPARγ）有顯著關(guān)聯(lián)，且與腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Sheu等[28]應(yīng)用 RT-PCR方法研究 10例 PTC，18例甲狀腺透明變梁狀腫瘤（HTT）及周?chē)＜谞钕俳M織，10例甲狀腺濾泡性腺瘤及10例非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（MNG）組織中5種miRNA（miR-146b、miR-181b、miR-21、miR-221、miR-222）表達(dá)的差異性中發(fā)現(xiàn)PTC中存在BRAF（V600E）基因突變、RET/PTC1和RET/PTC3基因重排，同時(shí) 5種 miRNA均表達(dá)上調(diào)，而在后四種組織中5種miRNA均低表達(dá)，且均無(wú)BRAF基因突變、RET/PTC1和 RET/PTC3基因重排；研究認(rèn)為HTT因?yàn)槿鄙貾TC中miRNA的表達(dá)模式和基因突變、基因重排的特征，從而不支持HHT可能是PTC透明變梁狀亞型的觀(guān)點(diǎn)。Nikiforova等[29]發(fā)現(xiàn)miR-221、miR-222、miR-146b在PTC樣本中無(wú)同時(shí)增高的趨勢(shì)，但在BRAF突變的多數(shù)樣本中表現(xiàn)為同時(shí)增高，而miR-187在RET/PTC和RAS突變的樣本中表達(dá)明顯增高。Ricarte等[30]研究發(fā)現(xiàn)，RET/PTC突變的細(xì)胞系中，增強(qiáng)的RET癌基因可降低miR-let-7f的表達(dá)，從而導(dǎo)致PTC的發(fā)生發(fā)展。Rippe等[31]發(fā)現(xiàn)在FTC中C19MC和miR-371-3基因簇接近于染色體19q13.4，而該區(qū)帶在甲狀腺腺瘤中常發(fā)生重排，在發(fā)生重排的細(xì)胞株中C19MC和miR-371-3基因簇表達(dá)顯著增高。Chou等[32]發(fā)現(xiàn)miR-146b在發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變的PTC患者中顯著高于未發(fā)現(xiàn)突變者，且與PTC的侵襲性有關(guān)，而Chen等[33]發(fā)現(xiàn)miR-146b在 PTC中過(guò)度表達(dá)，但與BRAF突變位點(diǎn)相獨(dú)立。因此miRNA的失調(diào)可能與甲狀腺腫瘤相關(guān)基因存在相關(guān)關(guān)系，但尚需要全面深入的研究。

4 miRNA在甲狀腺癌中的應(yīng)用前景

由于miRNA在體內(nèi)形成RNA沉默復(fù)合體，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默效應(yīng)，調(diào)控基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)生物發(fā)育、細(xì)胞分化與凋亡，并作為抑癌基因或致癌基因，以抑癌基因表達(dá)下調(diào)或癌基因表達(dá)上調(diào)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，從這種意義上理解，可以通過(guò)尋找具有致癌基因和抑癌基因性質(zhì)的miRNA作為腫瘤的診斷和生物治療提供新的靶標(biāo)。miRNA在多種腫瘤組織中擁有自己獨(dú)特的miRNA表達(dá)特征、生物標(biāo)記，人們可以利用這些標(biāo)記來(lái)對(duì)腫瘤進(jìn)行分型以及對(duì)預(yù)后指標(biāo)作出判斷。

多種 miRNA在 PTC、FTC、ATC及 MTC中過(guò)度表達(dá)或低表達(dá)，在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，運(yùn)用Northern Blot、miRNA芯片和 RT-PCR等方法研究 miRNA在甲狀腺癌中的表達(dá)譜，將有助于甲狀腺癌的早期診斷、高危人群的普查、預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、腫瘤的預(yù)后評(píng)估及靶向治療。

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