氯沙坦對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的改善及膽堿能系統(tǒng)活性的影響

陳江瑛等

[摘要] 目的 研究氯沙坦對(duì)血管性癡呆（VaD）大鼠認(rèn)知功能的改善和膽堿能系統(tǒng)活性的影響。 方法 將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分成四組：假手術(shù)組，模型組，氯沙坦低劑量[2 mg/（kg·d）]組，氯沙坦高劑量[5 mg/（kg·d）]組，每組10只。用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法（2VO）制備VaD大鼠模型，造模前予灌胃治療，Morris水迷宮測(cè)試治療后VaD大鼠認(rèn)知功能的改善情況，Tunel染色測(cè)定各組大鼠海馬腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的變化。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Bc1-2、Bax蛋白表達(dá)，并測(cè)定乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性。 結(jié)果 方差分析表明，潛伏期和跨越次數(shù)F值分別為33.23和25.20。氯沙坦灌胃治療的VaD大鼠，與未予治療的VaD大鼠組相比，治療組大鼠找到平臺(tái)的潛伏期縮短（P < 0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)增多（P < 0.01）；氯沙坦高劑量組較氯沙坦低劑量組逃避潛伏期時(shí)間減少，穿越平臺(tái)次數(shù)增多（P < 0.01）。方差分析表明，凋亡細(xì)胞、Bcl-2蛋白及Bax蛋白F值分別為155.58、215.79和428.95。與模型組相比，氯沙坦治療組大鼠腦組織海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，凋亡基因Bax蛋白表達(dá)降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；氯沙坦高劑量組與氯沙坦低劑量組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。方差分析表明，各組大鼠ChAT活力F值為13.61。氯沙坦治療組腦組織ChAT活力明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；氯沙坦高劑量組與氯沙坦低劑量組相比，腦組織ChAT活力顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 氯沙坦治療可以明顯改善VaD大鼠的認(rèn)知功能，其機(jī)制與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)、促進(jìn)乙酰膽堿的合成相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 氯沙坦；血管性癡呆；認(rèn)知功能；細(xì)胞凋亡；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶

[中圖分類號(hào)] R749.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）01（a）-0010-04

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是由一系列腦血管因素（缺血或出血或急慢性缺氧性腦血管病等）導(dǎo)致腦組織損害，引起以認(rèn)知功能障礙為特征的綜合征[1-2]。有研究表明，腦內(nèi)具有獨(dú)立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS），而RAS除調(diào)節(jié)血壓和水電解質(zhì)平衡外，還參與學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)。氯沙坦屬血管緊張素1型受體（AT1受體）阻滯藥，通過阻滯AT1受體對(duì)抗AngⅡ的作用。有研究顯示氯沙坦可進(jìn)入腦組織，拮抗腦局部AT1受體，下調(diào)腦局部RAS系統(tǒng)的作用而產(chǎn)生腦保護(hù)[3-4]。本研究采用VaD模型大鼠，觀察氯沙坦對(duì)VaD大鼠認(rèn)知功能的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 老齡健康雄性SD大鼠40只，月齡大于16個(gè)月，體重300～450 g，由中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物 氯沙坦（美國杭州默沙東公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20030654）。

1.1.3 試劑 凋亡TUNEL試劑盒（美國ROSS公司），兔抗大鼠Bax多克隆抗體（美國Epitomics公司），兔抗大鼠BCl-2多克隆抗體（美國CST公司），乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 血管性癡呆大鼠模型的建立及分組處理

將雄性SD大鼠用10%水合氯醛（0.035 mL/10 g）腹腔注射麻醉后，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并以“0”號(hào)絲線阻斷血流20 min，可以觀察到大鼠驚厥、呼吸深慢、心跳加快；同時(shí)在距鼠尾尖約1 cm處斷尾，放血約0.3 mL。松開絲線扣恢復(fù)血流10 min后，再次阻斷血流20 min，如此重復(fù)3次，第3次血流再灌注后觀察30 min，如大鼠呼吸、心跳平穩(wěn)，即可縫合皮膚，放回籠中正常飼養(yǎng)。其中假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，套絲扣；但不阻斷血流，尾部不放血，觀察時(shí)間、飼養(yǎng)條件與模型組相同。

造模前大鼠隨機(jī)分成四組，每組各10只：假手術(shù)組，模型組，氯沙坦低劑量[2 mg/（kg·d）]組，氯沙坦高劑量[5 mg/（kg·d）]組。手術(shù)當(dāng)天提前2 h灌胃，直至術(shù)后15 d。在灌胃后30 d，分別對(duì)上述各組大鼠進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，觀察各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶成績。術(shù)中假手術(shù)組大鼠無死亡，其余各組各有1只大鼠死亡。

1.3 Morris水迷宮測(cè)試

1.3.1 定位航行試驗(yàn) 水溫控制在25℃左右，每日上下午各4次，將大鼠面向池壁分四個(gè)象限放入水中，記錄其在2 min內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。如果大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，則用手牽引其至平臺(tái)上，讓大鼠停留20 s，再放回籠中，其潛伏期算120 s。歷時(shí)5 d。

1.3.2 空間探索試驗(yàn) 第6天撤除平臺(tái)，將大鼠任選1個(gè)入水點(diǎn)放入，記錄其2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞的表達(dá)

各組大鼠在行為測(cè)試完畢后以10%水合氯醛麻醉，立即開胸暴露心臟，左心室迅速插管至主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳，灌注生理鹽水100 mL，再灌注4%的多聚甲醛250 mL，速度先快后慢，至頸部非常僵硬為滿意，迅速取腦并分離左側(cè)海馬區(qū)組織，4%多聚甲醛中浸置4～6 h，經(jīng)乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明后，浸蠟包埋，5 μm厚切片，行免疫組化染色，嚴(yán)格按照說明操作。

1.5 氯沙坦對(duì)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力的影響

將上述各動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，選取6只不同劑量組的大鼠斷頭處死，制成10%的勻漿，采用相關(guān)試劑盒測(cè)定腦組織中ChAT的活力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

模型組所用逃避潛伏期時(shí)間明顯長于假手術(shù)組、氯沙坦高劑量組及氯沙坦低劑量組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）?？臻g探索試驗(yàn)結(jié)果顯示，氯沙坦高劑量組、低劑量組出現(xiàn)穿越平臺(tái)次數(shù)均高于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。氯沙坦高劑量組出現(xiàn)穿越平臺(tái)次數(shù)高于氯沙坦低劑量組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 氯沙坦對(duì)大鼠凋亡細(xì)胞、Bcl-2蛋白及Bax蛋白的影響

與假手術(shù)組比較，模型組凋亡基因Bax蛋白表達(dá)顯著增加（P < 0.01），抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降（P < 0.01）。與模型組比較，氯沙坦低劑量組、氯沙坦高劑量組抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加（P < 0.01），凋亡基因Bax蛋白表達(dá)降低（P < 0.01）。說明氯沙坦可能通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。氯沙坦高劑量組與低劑量組比較，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 氯沙坦對(duì)大鼠腦組織中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組腦組織ChAT活力顯著降低（P < 0.01），氯沙坦低、高劑量組腦組織ChAT活力明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。氯沙坦高劑量組與低劑量組比較，ChAT活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

中樞膽堿能機(jī)制和缺血后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡（DND）引起的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡是近年研究較為重視VaD的發(fā)生機(jī)制[5]。中樞膽堿能通路是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的主要通路，乙酰膽堿（ACh）是其中的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其濃度升高有利于學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)，降低則促進(jìn)癡呆的發(fā)生[6]。腦缺血時(shí)膽堿能神經(jīng)元退變，分解ACh增強(qiáng)，導(dǎo)致ACh濃度降低從而促進(jìn)癡呆的發(fā)生。ChAT活性被視為膽堿能神經(jīng)元最具體的指標(biāo)，ChAT活性降低的程度以及由此產(chǎn)生的ACh水平下降的嚴(yán)重程度與認(rèn)知能力下降密切相關(guān)，與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能障礙在動(dòng)物大腦中表現(xiàn)出ChAT活性顯著降低[7]。海馬CA1區(qū)對(duì)腦缺血有選擇易損性，海馬神經(jīng)元的凋亡丟失和缺血壞死影響了神經(jīng)元突觸的可塑性，影響了海馬對(duì)信息的處理和傳遞，引起腦缺血后記憶認(rèn)知功能損害。

近年的研究證實(shí)[8-10]，應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）阻斷劑減少AngⅡ的生成或阻斷其受體信號(hào)通路，能明顯改善腦血流量和認(rèn)知功能。Rozzini等[11]研究證實(shí)，卡托普利可以改善缺血性腦梗死患者的生活質(zhì)量，提高其認(rèn)知功能。推測(cè)其機(jī)制可能與卡托普利通過抑制腦源性AngⅡ的生成，間接提高腦組織ACh的濃度，從而改善認(rèn)知功能有關(guān)。Moretti等[12]研究發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)注入煙堿類膽堿能受體拮抗劑美加明可破壞雄性SD大鼠的空間學(xué)習(xí)能力， 再注AngⅣ可使其受損的空間學(xué)習(xí)能力恢復(fù)正常。說明AngⅣ對(duì)學(xué)習(xí)記憶的修復(fù)作用與腦中的膽堿能系統(tǒng)相關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中，采用氯沙坦對(duì)血管性癡呆大鼠進(jìn)行治療，可明顯改善大鼠搜索平臺(tái)的潛伏期和跨越平臺(tái)的次數(shù)，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。在實(shí)驗(yàn)中，VaD模型組大鼠CA1區(qū)Bax高表達(dá)，Bcl-2低表達(dá)，凋亡細(xì)胞增多，證實(shí)了長期低灌注可使海馬神經(jīng)元凋亡，影響認(rèn)知和記憶。氯沙坦低劑量組和高劑量組與模型組相比，均有Bcl-2的高表達(dá)，Bax的低表達(dá)，凋亡細(xì)胞也明顯減少。說明氯沙坦能抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元，改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的效果，其機(jī)制與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)相關(guān)。同時(shí)，氯沙坦可以有效提高ChAT活性，明顯改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提示氯沙坦可促進(jìn)ACh的合成，增加ACh與M受體的結(jié)合，這可能也是氯沙坦增強(qiáng)模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制之一。

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（收稿日期：2013-10-28 本文編輯：張瑜杰）